電子煙煙液及其主要化學成分的體外細胞毒性評價

陳 歡，韓書磊，張 森，史智浩，侯宏衛，胡清源

國家煙草質量監督檢驗中心，鄭州高新技術產業開發區楓楊街2號 450001

近年來，電子煙以“保健”“戒煙”“清肺”等為宣傳口號，以網絡為主要營銷途徑，在世界范圍的銷量呈快速增加趨勢。大多數電子煙產品宣稱其比傳統卷煙的危害性更小［1］。然而，目前對電子煙的毒性評價研究較少。Bahl等［2］采用 3-（4,5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴鹽法（MTT法）對電子煙煙液的細胞毒性進行評價，結果表明不同電子煙煙液的細胞毒性相差很大。Behar等［3］的進一步研究表明，電子煙產品中的肉桂添加劑成分與細胞毒性有關，會對電子煙消費者的健康產生影響。目前關于電子煙氣溶膠中有害成分及細胞毒性評價研究也有報道［4-6］。電子煙與普通卷煙的主要差異在于電子煙是通過霧化器霧化電子煙煙液形成氣溶膠，由于不需要經過傳統卷煙的高溫燃燒過程，不同化合物在煙液霧化為氣溶膠過程中的變化主要體現在遞送規律方面，因此大多數成分并不會發生化學性質方面的改變。可見，考察電子煙煙液的細胞毒性對于評價不同電子煙產品的生物學毒性具有重要意義。

常用的細胞毒性評價方法主要包括MTT法、中性紅吸收法、CCK-8法、WST-1實驗、乳酸脫氫酶（Lactate dehydrogenase,LDH）實驗及溴脫氧尿嘧啶核苷（BrdU）摻入實驗等。各種方法的檢測原理不同，優缺點也不一樣。MTT、CCK-8和WST-1實驗主要以活細胞線粒體經脫氫酶轉化后形成的甲瓚的量表征細胞活性，其中MTT生成的是不溶于水的藍紫色甲瓚，需要用有機溶劑溶解后再進行測定；WST-1和CCK-8生成的是水溶性的黃色甲瓚，無需洗滌和有機溶劑溶解就可以直接測定，因而重復性和靈敏性比MTT法更高［7］。中性紅實驗以細胞溶酶體攝入中性紅染料的能力表征細胞活性，雖然該方法的準確性和靈敏性也較高，但是中性紅溶液需要現配現用，實驗操作較為繁瑣［8］。LDH實驗通過檢測細胞膜受損后釋放到培養液中的乳酸脫氫酶的活性來表征細胞活性［8］。該方法操作簡單、重復性好，對損傷細胞膜毒物的檢測靈敏性和準確性較高。BrdU實驗的原理是將一種胸腺嘧啶核苷類似物BrdU摻入細胞合成的DNA中，在細胞DNA合成期時，BrdU會與胸腺嘧啶產生競爭并摻入到新合成的DNA中，利用BrdU抗體對摻入到DNA的BrdU的特異性識別可以檢測細胞活性［9］。該方法能敏感地評價會對DNA和DNA的合成造成損傷的物質［10］。

考慮到不同細胞活性評價方法的準確性和便捷性，本研究中分別采用LDH、BrdU、WST-1和CCK-8四種細胞毒性測定方法來評價電子煙煙液有關細胞膜損傷、細胞增殖和細胞活性等方面的細胞毒性，以篩選出檢測靈敏及檢測結果準確可靠的電子煙體外細胞毒性評價方法。同時，根據不同細胞系對測試化合物敏感程度的差異，分別采用中國倉鼠卵巢細胞（CHO細胞）和人肺癌細胞（A549細胞）進行相同電子煙煙液的細胞毒性評價對比，以篩選出適用于電子煙煙液細胞毒性評價的細胞株。本實驗中選擇16種電子煙煙液樣品進行考察，通過氣相色譜儀檢測主要成分煙堿、1,2-丙二醇和丙三醇的含量，并分析主要化學成分與電子煙煙液細胞毒性的相關性，旨在準確評價電子煙煙液的細胞毒性及其主要成分對細胞毒性的影響，為電子煙煙液細胞毒性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑和儀器

CHO和A549細胞（中國科學院上海生命科學院細胞庫提供）；16種電子煙煙液，均通過網絡途徑采購。

煙堿（AR，國家煙草質量監督檢驗中心提供）；丙三醇、1,2-丙二醇（AR，美國Sigma公司）；RPMI-1640培養基、0.25%胰蛋白酶及胎牛血清（美國Gibco公司）；LDH試劑盒、BrdU試劑盒及WST-1試劑盒（瑞氏Roche公司）；CCK-8試劑盒［東仁化學科技（上海）有限公司］。

MD Spectramax M5酶標儀（美國Molecular Device公司）；456-GC氣相色譜儀（配FID檢測器，美國Bruker Daltonics公司）。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養和染毒

CHO和A549細胞采用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養基培養，當細胞生長至匯合率為70%～80%時，采用0.25%的胰酶消化成單細胞懸液，在顯微鏡下計數后，向96孔細胞培養板（除最外周36孔）中加入100 μL 1×105個細胞/mL的單細胞懸液。細胞接種24 h后移除培養液，采用0.1 mol/L的磷酸鹽緩沖液洗滌1次后加入染毒液。每個處理進行6個平行實驗，細胞存活率表達均為平均值±標準偏差。

1.2.2 細胞毒性檢測

（1）LDH法。細胞接種24 h后開始染毒，分別設置正常對照組（不染毒）、不同劑量的電子煙煙液染毒組和LDH最大釋放組（不染毒，用于檢測細胞可釋放LDH酶的最大量），正常對照組和LDH最大釋放組均每孔加入100 μL的細胞培養基，電子煙煙液染毒組每孔加入100 μL不同濃度的電子煙煙液染毒溶液，96孔板的最外周36個孔中選擇其中6個孔作為培養基背景對照，再選擇6個孔加入最高電子煙煙液染毒溶液作為染毒溶液背景對照。在染毒步驟結束前15 min，向LDH最大釋放組中加入5 μL裂解液，繼續孵育15 min。向96孔板每孔中加入100 μL新配制的LDH反應混合液，避光反應15 min后，每孔加入50 μL終止液，振蕩10 s。使用酶標儀檢測每孔在490 nm波長處的吸光值，參比波長為630 nm。

（2）BrdU摻入法。細胞接種24 h后開始染毒，分別設置正常對照組（不染毒），電子煙煙液染毒組和培養基背景對照組。空白對照組中每孔加入100 μL細胞培養基、電子煙煙液染毒組中每孔加入100 μL電子煙煙液染毒溶液。染毒結束前2 h，每孔加入10 μL的BrdU染料，繼續孵育2 h，然后開始BrdU摻入量的檢測。吸除溶劑后每孔加入200 μL的細胞固定和變性溶液，室溫下孵育30 min。吸除培養孔中的溶液后，每孔加入100 μL過氧化物酶標記的抗BrdU抗體，室溫下孵育90 min。用300 μL清洗液清洗細胞培養板3次，每孔加入100 μL酶反應底物，反應30 min，檢測370 nm處的吸光度值。

（3）WST-1法。細胞接種24 h后開始染毒，分別設置正常對照組（不染毒、染毒組、陽性對照組（200 μg/mL SDS）和培養基背景對照組。染毒結束后，每孔加入10 μL WST-1試劑，繼續于37℃、5%CO2條件下孵育2 h。振蕩1 min后使用酶標儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光值，參比波長為630 nm。

（4）CCK-8法。細胞接種24 h后開始染毒，分別設置正常對照組（不染毒、染毒組、陽性對照組（200 μg/mL SDS）和培養基背景對照組。染毒結束后，每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續于37℃、5%CO2條件下孵育2 h。振蕩1 min后使用酶標儀檢測每孔在450 nm波長處的吸光值，參比波長為630 nm。

1.2.3 氣相色譜法檢測電子煙煙液中的煙堿、1,2-丙二醇和丙三醇

樣品前處理：稱取約0.1 g電子煙煙液樣品，精確至0.1 mg，置于50 mL錐形瓶內，再加入10 mL含有內標1,3-丁二醇和2-甲基喹啉的異丙醇溶液（1,3-丁二醇作為1,2-丙二醇和丙三醇內標，2-甲基喹啉作為煙堿內標），振蕩20 min后取約1 mL進樣分析。每個樣品應平行測定兩次。儀器分析條件為：

色譜柱：DB-ALC1（30 m×0.32 mm×1.80 μm）；程序升溫方式：初始溫度100℃，保持1 min，以15℃/min速率升至220℃，保持6 min；總運行時間為15 min；載氣：氦氣；載氣流速：1.8 mL/min；尾吹氣：20 mL/min；空氣：450 mL/min；氫氣：40 mL/min；進樣口溫度：250℃；檢測器溫度：275℃；進樣量：1 μL；分流比：50∶1。

1.2.4 數據處理

（1）LDH實驗中細胞存活率的計算公式：

式中：A為實驗組對應的吸光度值。下同。

（2）BrdU、WST-1和CCK-8實驗中細胞存活率的計算公式：

（3）采用GraphPad Prism 5軟件進行IC50值計算和圖形繪制，采用SPSS 20.0進行單因素ANOVA方差分析、t檢驗、Tukey多重比較和Pearson相關分析。

2 結果與討論

2.1 不同方法檢測的電子煙煙液的細胞毒性

采用LDH、BrdU、WST-1和CCK-8實驗對電子煙煙液的細胞毒性測定結果如圖1和表1所示。可以看出，染毒3 h后，所有方法均能檢測到電子煙煙液的細胞毒性，CCK-8法計算的IC50值最低（81.81 mg/mL），其次依次為WST-1、BrdU及LDH實驗。另外，采用CCK-8實驗計算的細胞毒性最低效應濃度（LEC）為20 mg/mL，遠低于LDH（100 mg/mL）、WST-1（70 mg/mL）和BrdU（50 mg/mL）實驗的LEC值，說明采用CCK-8實驗評價電子煙煙液染毒3 h后的細胞毒性最為敏感。暴露24 h后，所有方法獲得的電子煙煙液細胞毒性劑量-效應關系比3 h更明顯。可見，采用CCK-8實驗評價電子煙煙液染毒24 h后的細胞毒性最為敏感。綜上可知，LDH、BrdU、WST-1和CCK-8實驗4種方法均能用來檢測電子煙煙液的細胞毒性且均能獲得顯著的細胞毒性-效應曲線，但是各種方法檢測電子煙煙液細胞毒性的敏感性不同，其中CCK-8實驗的敏感性最高，其次依次為WST-1、BrdU和LDH實驗。

4種方法敏感性差異的主要原因可能是，除了與各方法的檢測原理有關外，還與電子煙煙液本身的化學性質有關。電子煙煙液的主要成分為丙三醇和1,2-丙二醇，而這兩種物質是細胞膜主要組分甘油三酯的重要組成成分，可能對保持細胞膜的完整性具有一定的積極作用，對于主要通過檢測細胞膜破損釋放乳酸脫氫酶活性的LDH實驗來說，檢測的敏感性相對較低。WST-1和CCK-8實驗主要通過檢測線粒體上的琥珀酸脫氫酶的活性來表征細胞毒性，由于線粒體是細胞內能量的生產中心，與細胞內各種生理活動均有著緊密的聯系，因而無論細胞內的何種生理活動受到有毒物質的損害后，均會間接反映線粒體電子呼吸鏈上氧化還原酶的活性。BrdU通過細胞內DNA的合成來表征細胞的增殖和活性，因而細胞內DNA合成相關活性受到有害因素的抑制或者損傷后，BrdU實驗能通過細胞內DNA的合成情況來準確反映細胞的增殖和生長活性。由于電子煙煙液主要的細胞毒性源于氧化應激［11］，因而WST-1和CCK-8實驗比BrdU實驗評價電子煙煙液的細胞毒性更為敏感。WST-1和CCK-8的實驗原理相似，但是兩者琥珀酸脫氫酶反應底物的化學結構不同，CCK-8的底物是WST-1的升級產品，與琥珀酸脫氫酶產生的甲瓚更穩定且更易溶于水，因此CCK-8實驗檢測電子煙煙液細胞毒性的靈敏度更高。

圖1 LDH、BrdU、WST-1和CCK-8實驗測定的電子煙煙液細胞毒性Fig.1 Cytotoxicity of e-liquids tested by LDH,BrdU,WST-1 and CCK-8 methods

表1 不同方法評價電子煙煙液染毒3和24 h的IC50和LEC值Tab.1 Values of IC50and LEC tested by different methods after 3 and 24 h exposure to e-liquids

2.2 不同細胞系對電子煙煙液細胞毒性的敏感程度

圖2 兩個電子煙煙液樣品對A549細胞和CHO細胞的細胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of two e-liquids to A549 and CHO cell lines

CHO細胞和A549細胞易于培養，生長速度快，維護成本低，是煙草行業體外毒性評價常用的兩種細胞系。本實驗中以CCK-8實驗為細胞毒性檢測方法，對CHO細胞和A549細胞在評價電子煙煙液細胞毒性時的敏感程度進行了分析，以獲得更適用于電子煙煙液細胞毒性評價的細胞系。由圖2可知，隨著電子煙煙液A和B的染毒劑量增加，細胞毒性逐漸增大，具有顯著的劑量-效應關系。雖然t檢驗表明電子煙煙液樣品A和B的濃度分別為70和20 mg/mL時，CHO細胞的存活率才顯著低于A549細胞的存活率（P<0.000 1），但是Tukey多重比較結果表明，當電子煙煙液樣品A和B的濃度為分別為40和20 mg/mL時CHO細胞的存活率就已經開始與空白對照組具有極顯著差異（P<0.000 1），而A549細胞在電子煙煙液樣品A和B的濃度為分別達到50和40 mg/mL時才開始與空白對照組具有極顯著差異（P<0.000 1）。因此，CHO細胞比A549細胞對這兩個電子煙煙液的細胞毒性更為敏感。

另外，比較這兩個電子煙煙液對A549細胞和CHO細胞的IC50值發現，電子煙煙液A和B對CHO細胞的IC50值（54.85和46.13 mg/mL）均比A549細胞的IC50值（59.77和50.47 mg/mL）更低。因此，CHO細胞比A549細胞對電子煙煙液的毒性更加敏感，更適合于電子煙煙液細胞毒性的評價。由于CHO細胞為亞二倍體細胞，A549細胞為亞三倍體細胞，A549細胞對毒物引起的毒性反應修復和耐受性更強，因此其對電子煙煙液細胞毒性的敏感性比CHO細胞差。

2.3 電子煙煙液的細胞毒性及其細胞毒性與主要成分含量的相關性

選擇CHO細胞為測試細胞系、CCK-8實驗為檢測方法，對市售的16種電子煙煙液的細胞毒性進行了普查分析。表2為16種電子煙煙液的IC50值。由表2可知，不同電子煙煙液的細胞毒性相差較大（最高相差5.47倍）。1,2-丙二醇和丙三醇是電子煙煙液的主要溶劑，含量分別為49.17%～77.55%和4.66%～46.94%，二者總量約占電子煙煙液的80%以上。電子煙煙液中煙堿含量為0～2.84%，檢出率在87.5%以上，煙堿最高約占電子煙煙液的3%。其他成分的總量為1.96%～33.34%，大多數在10%以下。不同生產廠家的電子煙煙液中化學成分的種類和含量存在較大差異，檢出的煙氣關注有害成分［12］包括：羰基化合物（如甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮及甲基苯甲醛等）、多環芳烴（如蒽、菲、1-甲基菲及芘等）、煙草特有亞硝胺（如NNN、NNK、NAT及NAB等）、重金屬（如鎘、鎳、鉛、砷及鉻等）、煙草生物堿（如可替寧、麥斯明、新煙草堿、假木賊堿、β-雪茄堿及去甲基煙堿等）以及揮發性有機物（如甲苯、間二甲苯及3-甲基丁基-3-甲基丁酸乙酯等）等。

表2 16種電子煙煙液的細胞毒性IC50值及其主要化學成分含量①Tab.2 IC50values and contents of main components in 16 e-liquids

將16種電子煙煙液的IC50值與其主要成分煙堿、1,2-丙二醇、丙三醇的含量水平進行線性回歸和Pearson相關分析，結果如圖3所示。可以看出，煙堿、1,2-丙二醇、丙三醇及其他成分含量的總和與對應電子煙煙液的IC50值間線性回歸相關系數R2值均小于0.1。另外，煙堿、1,2-丙二醇、丙三醇及其他成分總和的含量與對應電子煙煙液IC50值間的Pearson線性相關系數分別為0.026（P=0.924），-0.303（P=0.254），0.263（P=0.326）及-0.013（P=0.962），且均無顯著相關性（P＞0.05）。說明16種電子煙煙液中的煙堿、1,2-丙二醇和丙三醇與電子煙煙液的細胞毒性無顯著線性相關性。

圖3 16種電子煙煙液IC50值與煙堿（A）、1,2-丙二醇（B）、丙三醇（C）及其他成分（D）含量的一元線性回歸分析結果Fig.3 One-dimensional linear regression analysis between IC50values of contents of nicotine（A）,1,2-propylene glycol（B）,glycerol（C）and other components（D）in 16 e-liquids

原因可能是：①所分析的樣品數量較少，因而所得的線性關系不明顯；②由于單個物質之間對細胞毒性可能存在交互作用，因此這些主要成分與電子煙煙液的細胞毒性可能存在非線性關系。為此，需進一步對更多樣品中的成分和毒性進行檢測，并在此基礎上深入探索電子煙液中的這些主要成分是否與電子煙煙液存在非線性關系。

3 結論

通過對不同細胞毒性實驗、不同測試細胞系等條件的篩選，確定了適用于電子煙煙液細胞毒性評價的方法，即以CHO細胞作為測試細胞系，采用CCK-8實驗評價電子煙煙液的細胞毒性。對通過網絡途徑采購的16種電子煙煙液的細胞毒性進行了分析，考察了細胞毒性與電子煙煙液主要成分之間的相關性。盡管不同電子煙產品煙液的細胞毒性相差很大（最高相差5.47倍），但是本實驗中所分析的16種電子煙煙液的細胞毒性的差異與其主要成分（煙堿、1,2-丙二醇和丙三醇）的含量并無顯著的線性關聯。