脊髓損傷中相關microRNA的研究進展

劉 偉,祁 雷,李慶寧 綜述 荊玨華 審校

脊髓損傷(spinal cord injury，SCI)是一種死亡率高、致殘率高、醫療花費高的中樞神經系統 (central nervous system,CNS)疾病[1]，隨著現代社會經濟和交通建筑事業的發展，其發病率逐年上升，我國每年新增病例超過6萬人，給患者家庭以及社會帶來沉重的經濟負擔，已經引起醫師和學者的高度重視[2-3]。近 20 年來，隨著分子生物學的發展和人類基因組計劃的完成，臨床上發現了一類新的由內源基因編碼的長度約為24 個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子 (microRNA, miRNA)，它們在動植物體內參與轉錄后基因的表達調控[4]。研究[5]表明，miRNA在SCI后的病理生理發展過程中發揮著重要的調節作用。因此研究miRNA在SCI病理發展過程中的功能及作用，可以給SCI的診療與康復提供新的治療靶點和干預計策。

1 miRNA機制

1.1miRNA的形成機制miRNA是由20～24個核苷酸組成的單鏈非編碼RNA，其在表觀遺傳水平上調節蛋白質的表達。它們最初從基因組DNA轉錄，主要是通過RNA聚合酶II以初級miRNA轉錄物的形式轉錄。初級miRNA長度可以是數千個堿基對，形成含有由反向重復組成的莖環的功能性二級結構[6]，這些莖環被核糖核酸酶III識別和切割，導致從初級miRNA中釋放前體miRNA[7]。通過輸出蛋白5 (export protein 5, exportin-5)(參與核內RNA輸出的蛋白質)，前體miRNA被從 細胞核轉運到細胞質中，經過一種核糖核酸內切酶Dicer和一種RNA結合蛋白TAR 的RNA結合蛋白處理，形成成熟miRNA 和相似長度的互補鏈[8]，成熟的miRNA鏈一般具有生物活性，而互補鏈不具有生物活性，見圖1。

圖1 成熟miRNA的形成

1.2miRNA對SCI后的作用機制RNA誘導的沉默復合物(RNA-induced silencing complex, RISC)中包含Argonaute家族的蛋白質在促進miRNA對mRNA的靶向和結合起到關鍵作用[9], 兩者結合后由于mRNA的穩定性下降， miRNA-mRNA復合物的最終效果是降低蛋白質產量，見圖2。定量蛋白質組學研究[10]顯示，在生理條件下，單個miRNA可以下調數百種蛋白質的表達，但是變化的幅度很小(<4倍)。此外，降低蛋白質水平主要是由于mRNA不穩定而不是抑制翻譯。這些發現表明，雖然特定的miRNA可能具有廣泛的作用，但是對在細胞中引起功能相關變化相對較小。靶向類似途徑基因的多個miRNA在細胞中引起功能相關的變化較大。miRNA靶向含有與miRNA'種子序列'互補的mRNA，miRNA種子序列是在miRNA的5'端包含2～7個核苷酸的區域，其在miRNA-mRNA結合中具有關鍵作用[11]。 mRNA上的miRNA結合位點通常在物種間保守，并且在3'非翻譯區(untranslated region, UTR)中發現。 特定的miRNA可以在同一mRNA中具有多個結合位點，由此增強其整體效果。 然而，并不是所有的mRNA都被miRNA靶向。估計只有1/3的mRNA含有miRNA結合位點[12]。一些缺乏miRNA結合位點的mRNA轉錄物含有短的3'UTR，因此缺少miRNA結合域。 這種轉錄物逃避miRNA介導的抑制，許多這些“短”mRNA調節細胞的關鍵功能(DNA修復，蛋白質合成和增殖)。

1.3miRNA調控模式利用PicTar、MiRanda和TargetScan等生物信息學算法，可以預測miRNA的mRNA靶標。如上所述，一個miRNA可以結合許多不同的mRNA，并且相同的mRNA可以被不同的miRNA結合。 因此，相同miRNA可以調節功能上相關的基因家族的許多成員，由此增強miRNA介導的抑制的整體效應。 相反，同時上調靶向mRNA的多個miRNA，可以強烈抑制單個mRNA。 miRNAs能調控基因網絡的各種模式，突出了這些分子的效能。

圖2 miRNA的作用機制

2 相關miRNA

盡管miRNA 在人類疾病中的功能與作用尚需要進一步闡明，但是越來越多的研究表明，miRNA 可以作為一種全新的藥物靶點。本部分重點闡述SCI研究領域的熱點 miRNA 及其可能的分子機制，見表1。

2.1miRNA-21相關文獻[13]報道了在人類許多不同的疾病(主要是癌癥)中miRNA-21異常的表達現象，并且發現 miRNA-21表達上調與延長細胞存活、促進細胞生長、增殖以及減少細胞凋亡相關。研究[14]已證實miRNA-21的表達在許多CNS疾病如外傷性腦損傷(traumatic braininjury，TBI)中顯著上調，并且與TBI誘導的細胞凋亡和神經元可塑性有關。Hu et al[3]通過miRNA-21拮抗劑抑制神經元中的miRNA-21的表達，導致大鼠后肢運動功能恢復減弱，損傷部位范圍增大和正常組織范圍減少。與陰性對照組相比，用miRNA-21拮抗劑處理顯著增加了SCI后的細胞凋亡。促凋亡基因Fas配體(Fas ligand, FasL)、磷酸酶和張力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog, PTEN)和程序性細胞死亡蛋白4(programmed cell death protein 4, PDCD4)被證明是miRNA-21在許多疾病和細胞類型中的直接靶點，使用miRNA-21拮抗劑可增加體內FasL和PTEN的表達，但不影響PDCD4的表達。這些結果表明，miRNA-21在限制SCI后繼發性細胞死亡中發揮著重要作用，并且miRNA-21的保護作用可能是其對促凋亡基因的調節的結果[15]。

另一個動物模型中，SCI后5周，miRNA-21的表達也顯著增加，miRNA-21主要在培養的星形膠質細胞中表達[16-17]，提示miRNA-21在星形膠質細胞中的作用可能是SCI后修復的關鍵點。Bhalala et al[16]在小鼠的星形膠質細胞中通過轉基因過度表達了miRNA-21，結果顯示星形膠質細胞中miRNA-21的過度表達一方面降低了對SCI的肥大反應。另一方面，星形膠質細胞中miRNA-21的抑制可導致病變部位的軸突密度增加。

表1 相關miRNA的相關信息

這些發現共同證明了miRNA-21在SCI恢復中的新作用，這種 miRNA-21對細胞增殖和生長的影響因細胞類型而異。在星形膠質細胞中有抑制作用，但在神經元中有促進作用。因此為了最大化發揮miRNA-21的治療潛力，有必要對這些細胞特異性進行調節。

2.2miRNA-124CNS中特異性表達最為豐富的是miRNA-124。miR-124有3種亞型，其中以miRNA-124a最為常見。miRNA-124在急性脊椎外傷所致急性SCI中可能具有確診價值。陳聚伍 等[18]研究發現脊髓完全損傷組、脊髓不完全損傷組患者外傷后24 h內的外周靜脈血的 miRNA-124、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平都高于神經功能正常組，表明以上兩項指標對于脊椎外傷患者的急性 SCI的確診均有指導意義，其中miRNA-124診斷急性 SCI的特異度(90%)和靈敏度(90%)均高于TNF-α的特異度80%和靈敏度76.7%。所以有望將miRNA-124作為確診脊椎外傷后急性SCI 的潛在檢測標志物。 Song et al[19]在 SCI大鼠模型中研究了miR-124修飾的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMSCs)移植修復大鼠 SCI的機制。研究[19]發現，miR-124加速了 BMSCs向神經細胞的分化，促進了 SCI的修復。miRNA-124的過度表達抑制吡哆醛激酶(pyridoxal kinase，PDXK)的表達，這可能是miRNA-124如何促進 BMSCs分化的一個可能的機制，這項發現可能為 SCI治療提供了一個新的目標。

2.3miRNA-133-bmiRNA-133-b通過降低ras同源蛋白A (ras homology protein A, RhoA)的表達來作為成年斑馬魚脊髓再生的重要決定因素[20]。Conrad et al[21]發現成年斑馬魚的SCI模型在脊髓橫斷后的再生腦干神經元中的miRNA-133-b表達被極度上調，反義嗎啉代誘導的miRNA-133-b表達下調導致運動恢復減弱并軸突再生減少。miRNA-133-b靶向調節 RhoA，其表達在SCI后顯著上調，而 RhoA的抑制促進了皮質脊髓束的修復，并通過減少 SCI后組織損傷來發揮神經保護作用[22]。這些研究使得miRNA-133-b和RhoA成為在SCI中具有吸引力的治療靶點。

2.4miRNA-486與miR-21相類似，在鼠挫傷模型中SCI后第7天，同樣檢測到miRNA-486表達的增加。Jee et al[23]研究已經證明，將miRNA-486輸注到健康小鼠的脊髓中會降低運動功能并增加神經元死亡。 相反，在小鼠SCI模型中敲除miRNA-486可以改善后肢功能恢復[24]。 運動神經元中miRNA-486的主要靶點是神經原性分化6 (neurogenic differentiation 6, NeuroD6)，它是神經元分化和氧化應激反應的重要蛋白質[25]。 NeuroD6誘導SCI后谷胱甘肽過氧化物酶3(glutathione peroxidase 3，GPx3)和硫氧還蛋白樣1(thioredoxin-like 1，TXNL1)的表達，可以有效清除 SCI中過度活性氧(reactive oxygen species, ROS)并減輕炎癥[24]?；谶@些發現，有希望的SCI治療策略是可以通過上調NeuroD6表達來抑制miRNA-486，從而達到降低細胞凋亡并改善SCI后的功能缺陷的目的。

2.5miRNA-219和miRNA-338由脊髓CNS中的少突膠質細胞(oligodendrocytes，OLs)形成的髓鞘使軸突絕緣，從而加快動作電位傳播。OLs損傷后髓鞘修復失敗使衰弱性疾病中的脫髓鞘持續存在，如多發性硬化和腦白質營養不良[26]。miRNA-219和miRNA-338在成熟OLs中優先和大量表達[27-30]，兩種miRNA在從脊椎動物到人類的基因組進化中相對保守。Wang et al[31]研究發現miRNA-219缺陷不影響少突膠質前體細胞(oligodendrocytes precursor，OPC)形成，但是在發育過程中抑制它們的分化，miRNA-338對于CNS中的正常 OLs髓鞘形成不是必要的，但是miRNA-219在髓鞘形成中與miRNA-338協同能促進CNS 中的髓鞘修復。

3 總結與展望

到目前為止，已能證實單一 miRNA能夠調節SCI后的關鍵過程，例如調控細胞炎癥、死亡和凋亡。這些結果表明miRNA可以參與調控SCI后的繼發損傷，促進損傷后的再生過程，從而有助于減輕SCI后的功能障礙。然而，CNS損傷后發生的細胞和分子變化是多種多樣的，這就使單靶點治療的療效大大降低。由于眾多miRNA可通過多種機制作用于靶RNA，參與SCI疾病的預后，因此針對各種途徑中的多種miRNA組合進行相關研究是必要的。開發基于miRNA治療是實現這一目標的有吸引力的手段。這篇綜述討論了SCI后miRNA的變化以及這些變化的生理和病理效應。然而，目前對SCI發病機制的了解仍然有限，需要做更多的研究來探索SCI相關miRNA的功能和靶點。