梁棟國，王雅婷，羅睿宇，魏 強 綜述 呂世棟 審校

前列腺癌(prostate cancer, PCa)是源自前列腺上皮的惡性腫瘤，好發于中老年男性，近年來有年輕化的趨勢。前列腺癌發病率在歐美等發達國家位居所有腫瘤第一位，死亡率居第二位，僅次于肺癌[1]。我國前列腺癌的發病率低于歐美，但最近幾年呈現上升趨勢。前列腺癌的危險因素包括：肥胖、高齡、遺傳因素[2]。激素敏感型前列腺癌(hormone-sensitive prostate cancer，HSPC)、去勢抵抗型前列腺癌(castration resistance to prostate cancer,CRPC)、轉移性去勢抵抗型前列腺癌(metastatic castrate-resistant prostate cancer, mCRPC)為前列腺癌發展的三部曲。早期前列腺癌主要治療手段包括手術切除、根治性放射療法等，但當發生轉移，則主要采用雄激素剝奪療法(androgen deprivation therapy，ADT)和化療。在大多數情況下，HSPC會在1～3年內對ADT治療產生耐受性，發展成為CRPC，再進一步發展可發生侵襲轉移。CRPC可以在ADT下繼續增殖，而mCRPC更是提示患者預后不佳，給臨床治療帶來了巨大的挑戰[3]。CRPC的形成可能與雄激素受體(androgen receptor, AR)的擴增、突變、敏感性增加、來自腫瘤微環境中雄激素及類生長因子的活化有關；長鏈非編碼RNA(long non-coding RNAs, lncRNA)是核苷酸數超過200nt、缺少開放閱讀編碼框的一類RNA,包括正義lncRNA、反義lncRNA、雙向lncRNA、基因間lncRNA以及基因內lncRNA等，其中，近年研究顯示，lncRNA中的HOX轉錄反義RNA可能在CRPC的形成以及PCa的侵襲以及轉移中扮演重要角色。

1 HOTAIR概述

HOX轉錄反義RNA(HOX transcript antisense RNA，HOTAIR)是第一個被發現具有反式轉錄調控作用的lncRNA，HOTAIR基因包含 6 232 bp，位于12號染色體的同源框C(HOXC)基因簇內并編碼2.2 kb lncRNA分子，借助Suz-12蛋白從12號染色體穿梭到2號染色體，從而對2號染色體的基因產生影響[4]。HOTAIR可作為模式支架為至少兩種不同的組蛋白修飾復合體提供結合面，來選擇性地聚集相關的組蛋白修飾酶，從而確定靶基因組蛋白的修飾模式。研究顯示，HOTAIR同時促進與多硫疏蛋白抑制復合體 (polycomb repressive complex 2，PRC2) 和組蛋白賴氨酸去甲基化酶(lysinespecific demethylase1，LSD1) 結合，上調組蛋白H3K27甲基化水平，封閉染色體，進而沉默基因表達[5]。Rinn團隊證實，HOTAIR是PRC2沉默HOXD基因座的必需條件[6]。

目前表明，HOTAIR參與多個惡性腫瘤的致病過程。首先，HOTAIR 在多種腫瘤中表達上調，且與疾病不良預后密切相關。Gupta et al[7]發現在乳腺癌的原發灶和轉移灶組織標本中 HOTAIR 表達均升高；Yang et al[8]的研究發現 HOTAIR 的高表達與肝癌的轉移和復發以及肝癌細胞的耐藥性密切相關；Kogo et al[9]的研究也證實高表達HOTAIR的結腸癌細胞增殖能力增強。此外，在胃腸道腫瘤[10]、胰腺癌[11]、喉癌[12]、鼻咽癌[13]及肺癌[14]等惡性腫瘤中，也顯示HOTAIR 的表達水平與上述惡性腫瘤的臨床分期以及淋巴轉移等有明顯的關聯，多組數據表明HOTAIR高表達的患者預后不佳。這提示 HOTAIR高表達可能在各類腫瘤的發生、轉移侵襲中扮演重要角色，HOTAIR可以作為一個新的腫瘤預后分子標記。

研究[15]表明，HOTAIR與PRC2的結合，可增加Wnt/β-catenin信號通路的關鍵抑制因子WIF-1啟動子區域H3K27的甲基化程度，沉默WIF-1基因，從而激活Wnt/β-catenin通路，引起細胞核內轉錄因子β-catenin積聚，進而調控VEGF、MMP-7、cyclinD1等下游基因的表達，誘導腫瘤血管形成、促進腫瘤侵襲與遷移以及發生生長抑制逃逸。Li et al[12]發現，HOTAIR通過增加 ATK 通路上游的抑癌基因PTEN 啟動子的甲基化率，沉默PTEN基因的表達，引起Akt 通路的活化，使得Akt下游的MMP-9等基因表達上調，BAX、FOXO1 等基因表達下調，從而促進腫瘤侵襲與轉移并減少細胞凋亡；此外，活化的Akt蛋白可抑制p53蛋白活性，進而促進Bcl-2表達、抑制Bax表達，抵抗腫瘤細胞凋亡；HOTAIR也可以通過Akt及p53上調VEGF等促血管生成因子并下調TGF-β等抗血管生成因子的表達來誘導腫瘤的血管生成[16]。活化的Akt還可以下調p21的表達，解除p21 對一系列Cyclin-CDK復合物活性的抑制，增加Rb蛋白的磷酸化，進而增加E2F 轉錄因子活性，使細胞通過G1期，促進腫瘤細胞的增殖[17]。綜上，HOTAIR與PRC2的結合，會同時促進腫瘤細胞中組蛋白H3K27三甲基化(histone H3 tri-methylated at lysine 27，H3K27me3)形成，從而影響WIF1、PTEN、p21等基因的表達，并通過這些基因調控Wnt、Akt及p53等信號通路，從而在腫瘤的細胞周期、凋亡、血管生成、侵襲與轉移等過程中發揮重要功能。最近研究[18]顯示，HOTAIR在CRPC中表達上調，并和CRPC的AR再活化關系密切，這提示HOTAIR可能在CRPC發生發展中起著至關重要的作用。

2 HOTAIR與PCa的關系

2.1HOTAIR促進PCa增殖、侵襲與轉移使用小干擾RNA敲除HOTAIR后，與對照組相比，細胞增殖受到顯著抑制；細胞凋亡檢測表明敲除HOTAIR可以顯著誘導細胞凋亡；細胞周期測定顯示，在敲除HOTAIR后，停滯在G2/M期或者S期等細胞周期的細胞數量顯著增加。HOTAIR在晚期轉移性PCa中高表達，當敲除HOTAIR后，前列腺癌細胞的增殖受到抑制，并發生凋亡，這提示HOTAIR在PCa細胞增殖起著重要的作用[19]。

除此之外，研究還表明，HOTAIR還可以促進PCa的轉移與侵襲。前列腺癌微環境中的免疫細胞會影響PCa的進展，其相關機制可能涉及HOTAIR信號通路。前列腺癌細胞比正常前列腺上皮細胞更容易招募肥大細胞浸潤，ADT治療后的前列腺癌招募效果更甚，浸潤的肥大細胞可以增加前列腺癌的轉移和侵襲。研究[20]顯示，侵襲階段PCa中的lncRNA-HOTAIR與PRC2復合物結合增加；在敲低PCa中AR基因的表達后，CD133+干/祖細胞群增加，這表明PCa中CD133+干/祖細胞群增加可能與AR表達下調有關；此外，在AR低表達后，PCa中的基質金屬蛋白酶-9(matrixmetallopeptidase 9，MMP9)表達上調。由于MMP9是與PCa轉移相關的基因，干/祖細胞具有較高的侵襲能力[21]，兩者均可導致PCa細胞侵襲與轉移能力的增強。總的來說，在招募肥大細胞的浸潤后，PCa的LncRNA-HOTAIR與AR基因5'啟動子區域結合，進而對PRC2復合物實施調節，從而減少AR轉錄。在AR轉錄受到抑制后，PCa中的MMP9表達增加和(或)CD133+干/祖細胞群數量增加，從而增強PCa細胞的侵襲與轉移能力。在這個過程，LncRNA-HOTAIR起著至關重要的作用。這些新發現提示，將來或許可以通過靶向抑制LncRNA-HOTAIR表達的方法，實現對PCa的有效治療。

2.2HOTAIR促進CRPC進展HSPC、CRPC、mCRPC為前列腺癌發展三部曲，CRPC可以不依賴雄激素而繼續增殖，給臨床治療帶來了巨大的挑戰。近期研究[22]表明，HOTAIR與CRPC進展具有密切相關性。在雄激素剝奪的PCa細胞中進行細胞增殖測定，結果顯示HOTAIR過度表達確實能夠增加在雄激素缺乏環境下的PCa細胞的增殖，而敲低HOTAIR表達則消除了雄激素非依賴的細胞增殖。臨床上，抗雄激素藥物早期可以顯著降低PSA的水平，但隨著治療時間的延長，在治療后期，PSA會逐漸上升。更為重要的發現是，在進行抗雄激素藥物治療后，前列腺癌細胞中的HOTAIR表達會逐漸增加。這些研究結果表明，HOTAIR表達上調可能至少部分地解釋抗雄治療失敗的原因，包括恩雜魯胺(enzalutamide)耐藥的產生，提示HOTAIR過表達或許可以促進CRPC的進展，為臨床治療CRPC提供新的思路。

3 HOTAIR與雄激素受體(AR)的關系研究

雄激素信號通路在PCa的發生、去勢抵抗以及侵襲遷移中起著重要的作用，近年來的研究顯示HOTAIR與前列腺癌的去勢抵抗以及侵襲遷移密切相關，明確HOTAIR與雄激素受體的關系，弄清去勢抵抗環境中雄激素受體(AR)活化的機制，有助于從分子水平理解PCa的去勢抵抗以及侵襲遷移的形成機制，從而為治療CRPC提供新的分子靶點，推動CRPC治療藥物的實驗研究和臨床應用。

3.1生理條件下雄激素抑制HOTAIR的表達已知AR能夠通過染色質環的介導作用實現與增強子的強結合以及與啟動子的弱結合來調節靶基因[22]。通過染色質免疫沉淀測序(chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq)顯示，在HOTAIR基因上游46 kb和下游的66 kb與137 kb分別有三個強AR結合位點。同時模體統計分析顯示，HOTAIR啟動子上有三個雄激素反應元件(androgen response element,ARE)，實驗[22]表明，AR也可以與HOTAIR啟動子結合。在ChIP-qPCR比較實驗中，雄激素可顯著促進AR與HOTAIR啟動子的結合。說明AR能夠與HOTAIR的增強子以及啟動子結合，并且這種結合受到雄激素的正向調控。

進一步通過HOTAIR部分缺失的探針實驗顯示，HOTAIR前360 bp的區域與AR蛋白的結合有關[22]；RNA pull down等實驗表明AR的N-末端域(N-terminal domain, NTD)直接作用于HOTAIR lncRNA的5’末端，而與AR的DNA結合域(DNA-binding domain,DBD)以及配體結合域(ligand-binding domain, LBD)無關[22]。RNA聚合酶IIChIP-qPCR顯示，HOTAIR和幾種已知可以被AR抑制的基因的RNA聚合酶Ⅱ占據率下降，但在AR激活的基因如PSA和KLK2的RNA聚合酶Ⅱ占據率上升，這說明HOTAIR在轉錄水平受到雄激素的抑制作用；隨后的qRT-PCR分析顯示,LNCaP細胞系中HOTAIR的表達對雄激素高度敏感并且受到雄激素的顯著抑制。在其他的前列腺癌細胞系中，細胞接受了雄激素治療后也出現了相似的HOTAIR表達受限的結果。而敲除LNCaP細胞系中的AR基因后，HOTAIR的表達恢復；通過RNA衰變測定顯示乙醇和雄激素處理的細胞中的HOTAIR降解的速率沒有顯著差異，排除了雄激素通過影響RNA穩定性從而抑制HOTAIR的作用機制。因此HOAIR是一個在轉錄水平受到雄激素抑制的lncRNA，這種抑制作用通過AR介導。

3.2CRPC中HOTAIR輔助ADT后雄激素軸的再活化

3.2.1HOTAIR在CRPC中表達升高 生理情況下，細胞中的HOTAIR表達會被雄激素所抑制。然而，在對PCa患者進行去勢治療后，由于體內雄激素水平的下降，HOTAIR的抑制被解除，表達顯著升高。通過對PCa細胞系進行qRT-PCR分析，可以觀察到HOTAIR在CRPC細胞系模型如LNCaP-abl和C4-2B中急劇上調；重新分析了兩個公開可用的數據集，結果顯示與局限性PCa相比，HOTAIR在轉移性CRPC中顯著上調；同時，根據生化復發將局部PCa分為兩組，結果顯示HOTAIR在復發性PCa患者中顯著上調；在PCa組織微陣列中進行了RNA原位雜交后，表明HOTAIR表達在復發性PCa中的確明顯強于非復發性PCa[22]。

3.2.2HOTAIR可以穩定AR蛋白并延緩AR降解 當細胞系中的HOTAIR過表達后，AR蛋白水平也顯著增加，但翻譯AR蛋白的mRNA卻并沒有增加；將細胞中的HOTAIR基因敲除后，AR蛋白降解加速，這說明HOTAIR與AR蛋白的穩定性相關。MDM2是一種E3連接酶，通過作用于AR的N-末端域，導致AR蛋白泛素化，進而被降解[23]。實驗證實，HOTAIR的5’端與AR蛋白的N-末端域結合，從而阻斷E3連接酶MDM2與AR的相互作用，抑制了AR蛋白的泛素化和降解，從而穩定了AR蛋白。雄激素誘導的配體結合也有穩定AR蛋白的作用[24]。

3.2.3HOTAIR增強AR的轉錄活性 提取細胞核中游離以及與染色質結合的蛋白質組分，進行蛋白質印跡分析，結果顯示HOTAIR的表達顯著增加細胞核中AR的含量，并促進了AR與染色質上雄激素結合位點(AR-binding site，ARBS)的結合。使用位點特異性引物在幾種已知的AR靶基因上進行AR ChIP-qPCR，結果顯示HOTAIR過表達能增加PSA、TMPRSS2、FKBP5、OPRK1和MET等AR誘導基因的增強子AR的招募[25]；與AR誘導基因增強子招募AR增加一致，qRT-PCR也證明了HOTAIR可以增加AR誘導基因的表達，而降低AR抑制基因的表達；此外，RNA干擾敲除AR可以完全消除HOTAIR誘導的AR靶基因的表達。這些結果表明HOTAIR可以促進AR-染色質的結合并增強AR的轉錄活性。

3.2.4HOTAIR驅動雄激素非依賴性的AR染色體定位 蛋白質印跡分析顯示，即使在缺乏雄激素的情況下，HOTAIR的表達仍能顯著增加LNCaP細胞核中的AR含量；基因組瀏覽器視圖證實，HOTAIR的過表達促進TMPRSS2、FKBP5、PSA和KLK2等AR靶基因的增強子處AR的結合； 此外，ChIP-qPCR也證實，即使是在缺少雄激素的條件下，HOTAIR的過表達也能明顯促進AR蛋白與靶基因的結合。最重要的是，在C4-2B細胞中進行HOTAIR敲除后，AR與靶基因結合的數量極大減少，這表明HOTAIR是CRPC細胞中雄激素非依賴性AR活化的必需條件[22]。綜上所述，HOTAIR的表達在誘導和維持雄激素非依賴性AR的活化以及AR在染色體定位中起決定性作用，這從分子機制上增加了人們對CRPC形成的認識，明晰了人們對HOTAIR與雄激素非依賴性AR的活化以及CRPC形成這三者之間的關系，為臨床有效改善CRPC的治療提供新的思路和手段。

3.2.5HOTAIR在ADT下誘導啟動AR的轉錄程序 70%HOTAIR介導的AR結合位點與雄激素介導的AR結合位點重疊，這支持HOTAIR不是重編程AR而是主要增加AR活性。AR ChIP-seq的熱圖分析結果證實，在ADT條件下，HOTAIR過表達誘導的AR結合譜與雄激素刺激的AR結合譜極為相似；并且HOTAIR與雄激素在介導AR與染色體結合最大化上顯示出協同作用；此外，Treeview熱圖分析表明，大部分HOTAIR誘導基因也同時受雄激素誘導，而HOTAIR抑制基因也受雄激素抑制；基因富集分析(gene set enrichment analysis，GSEA)以及qRT-PCR均證實，雄激素誘導基因受HOTAIR誘導表達顯著上調，而雄激素抑制基因則受HOTAIR抑制表達下調[22]；ChIP-qPCR 分析也顯示，敲除HOTAIR阻斷了雄激素介導的AR活化；實時熒光定量PCR檢測同樣顯示，敲除HOTAIR抑制了AR轉錄活性，這都說明HOTAIR是在ADT下AR與靶基因結合的必需條件。

總的來說，生理條件下的雄激素可以抑制HOTAIR基因的表達；當在低雄激素環境中，如在ADT下，隨著雄激素抑制作用的解除，HOTAIR基因會過表達，活化的HOTAIR可穩定AR蛋白，延緩AR降解，增強AR的轉錄活性，促進AR的活化，從而在ADT環境下促進CRPC的形成、進展。

4 展望

在ADT后，HOTAIR在PCa中高表達，并增強PCa的侵襲與轉移以及促進CRPC形成，因此HOTAIR或許可以成為預測CRPC形成的有效指標[26-27]，早期監測PCa中的HOTAIR表達水平，可能可以及早發現CRPC形成的趨勢，并及早進行臨床干預，阻斷CRPC的形成。不過，在早期發現CRPC形成的趨勢后，如何有效阻斷CRPC的形成仍是一個亟需解決的難題，這需要更進一步的研究和探索。無論如何，這給臨床醫師以及研究者提供一個新的思路：或許可以通過早期監測PCa中的HOTAIR表達水平，早期預測干預以阻斷CRPC的形成，而不是等到CRPC已經形成后。此外，HOTAIR是低雄性激素環境下AR再活化的主要驅動因素，可以促進AR與靶基因的結合，增強AR的轉錄活性，從而導致PCa可以不依賴雄性激素而繼續增殖，促進CRPC的形成。這加深了人們對CRPC形成分子機制的認識，為臨床治療CRPC提供新的分子靶點，推動相關藥物的研究，從而為改善目前CRPC的治療現況帶來新的希望。HOTAIR還促進PCa的侵襲與轉移，HOTAIR也可能成為延緩甚至阻止PCa侵襲遷移的新靶點。