散發(fā)性結(jié)直腸癌微衛(wèi)星不穩(wěn)定狀態(tài)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

蔣 娜，隋燕霞，蔣依娜，張冠軍

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是全世界第三高發(fā)惡性腫瘤，2015年CRC約占到全世界癌癥總數(shù)的9.7%[1]。CRC的發(fā)生是一系列復(fù)雜的基因疾病的結(jié)果。微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability，MSI)的腫瘤被定義為免疫組化(immunohistochemistry,IHC)染色檢測有一個或多個錯配修復(fù)蛋白(mismatch repair protein，MMR)缺失或基因檢測表現(xiàn)出高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high frequency microsatellite instability，MSI-H)。MSI占散發(fā)性CRC的15%，其具有獨特的發(fā)生機制、預(yù)后、治療方案以及與林奇綜合征(Lynch syndrome，Lynch)有密切的關(guān)系。IHC法檢測MMR缺失的被認可和使用，使得檢測MSI變得簡便易行，有利于為腫瘤治療提供策略。秦云 等[2]證明此法的敏感度為94.9%，特異度為100.0%。目前關(guān)于MSI的研究不僅僅局限于發(fā)病機制上，其與CRC預(yù)后的關(guān)系也成為目前研究的熱點。該研究通過分析CRC的臨床病理特點與MSI的關(guān)系和隨訪CRC患者的生存狀態(tài)，探討MSI對中國人散發(fā)性CRC生存的影響。

1 材料與方法

1.1病例資料收集西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院2014年1月～2016年12月經(jīng)手術(shù)切除的CRC患者標(biāo)本中213例的腫瘤組織與遠離腫瘤組織正常直腸黏膜組織,有家族性腺瘤性息肉病的患者被排除。另外，入選病例術(shù)前均未行放、化療。在分析的213例患者中，男118例，女95例；年齡19～92歲，中位年齡59歲，生存時間定義為自手術(shù)治療之日至末次隨訪日或死亡所經(jīng)歷的時間，以月為單位計算。至研究終點(2017年12月)。依據(jù)2010版WHO組織學(xué)分級系統(tǒng)，將CRC分為高、中、低分化，如超過50%的腫瘤細胞表現(xiàn)為粘液分化，則被歸為粘液腺癌。

1.2研究方法標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、包埋，4 μm切片，HE染色，光鏡觀察，并應(yīng)用免疫組化Envision法染色。所用免疫組化一抗錯配修復(fù)蛋白MSH2(mutS homolog 2)、錯配修復(fù)蛋白MSH6(mutS homolog 6)、錯配修復(fù)蛋白MLH1(mutL homolog 1)、錯配修復(fù)蛋白PMS2(PMS1 homolog 2)及二抗[為鼠兔通用型抗體，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色]購自福州邁新公司。采用Ventana BenchMark XT system進行免疫組化染色。按照全部腫瘤細胞核均無著色方判定為該蛋白表達丟失。周圍間質(zhì)細胞和浸潤淋巴細胞作為內(nèi)對照。有MMR蛋白表達缺失的病例判定為MSI，未出現(xiàn)MMR蛋白表達缺失的判定為微衛(wèi)星穩(wěn)定(microsatellite stability,MSS)。MSI檢測采用PCR-毛細管電泳法檢測，選擇腫瘤及遠離腫瘤的正常切緣組織，采用德國Qiagen公司的DNA提取試劑盒(QIAamp DNA FFPE Kit)提取石蠟組織中的DNA，采用美國Promega公司的MSI檢測試劑盒特異性擴增Bat25、Bat26、NR-21、NR-24、MONO-27位點，使用美國ABI公司Applied Biosystems 3500對擴增產(chǎn)物進行檢測，使用GeneMapper4.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法,生存分析采用Kaplan-Meier法并繪制生存曲線、Log-rank法比較組間生存時間的差異，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1CRC組織中MMR蛋白MLH1、MSH2、MSH6、PMS2免疫組化表達缺失率35例發(fā)生MMR蛋白表達缺失，見圖1，其中12例為MLH1蛋白和PMS2蛋白表達缺失；6例為MSH2蛋白和MSH6蛋白表達缺失；4例為MSH2蛋白表達缺失；12例為MLHl蛋白表達缺失；1例為MSH6蛋白表達缺失。本研究顯示MMR蛋白表達缺失病例多為腫瘤組織學(xué)分級為低分化，病理分型為粘液腺癌，右半結(jié)腸腫瘤，并與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及分期相關(guān)，MSI患者中只有4例發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，大多數(shù)為Ⅱ期患者。而與患者年齡、性別、脈管浸潤、神經(jīng)浸潤無顯著相關(guān)性。見表1。

圖1結(jié)直腸癌患者MMR表達情況×200

A：MSH2陽性；B：MSH6陽性；C：MLH1陽性；D：PMS2陽性；E：MMR蛋白陰性

2.2MSI檢測結(jié)果隨機抽取20例標(biāo)本進行PCR-毛細管電泳法檢測，其中3例腫瘤組織顯示高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(high frequency microsatellite instability，MSI-H)，其中1例腫瘤組織顯示低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定(low frequency microsatellite instability，MSI-L) ，其余腫瘤組織顯示MSS，見圖2。

2.3生存分析隨訪時間截止到2017年12月結(jié)束，41例(19%)的CRC患者死亡，均死于腫瘤復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，隨訪時間12～48個月，中位隨訪時間25個月。12例(6%)患者失訪。同樣，MSI患者總體生存時間(overall survival time，OS)高于MSS患者，預(yù)后較好(OS：χ2=4.004，P<0.05)，見圖3。

3 討論

CRC在男女均是高發(fā)腫瘤，平均發(fā)病年齡62歲[3]。 Thibodeau et al[4]對導(dǎo)致Lynch綜合征的錯配修復(fù)基因進行微衛(wèi)星研究，由此認識到一種定義為MSI的現(xiàn)象。MSI通路是由于DNA錯配修復(fù)基因失活而發(fā)生，約15%的散發(fā)性CRC是由此發(fā)生。其病因通常是人類MLH1錯配修復(fù)基因(human MutL homolog 1，hMLH1)啟動子甲基化，MMR基因沉默導(dǎo)致IHC顯示相關(guān)MMR蛋白陰性，表現(xiàn)MSI。然而，在散發(fā)性CRC，MSI的特征和重要性還知之甚少，并且MSI能否預(yù)測CRC患者預(yù)后仍有爭論。

表1 MSI和MSS 結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的比較

本研究顯示，大約16%的腫瘤表現(xiàn)為MSI，這一結(jié)果與之前的研究[5]結(jié)果基本一致。而且采用PCR-毛細管電泳法檢測與IHC染色檢測MMR蛋白獲得的MSI-H比例一致。本研究結(jié)果還表明，MSI結(jié)直腸癌具有明顯的臨床病理特點，如多位于右半結(jié)腸，組織學(xué)多為粘液腺癌，組織學(xué)分級多為低分化，疾病分期早，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移少見。有文獻[6]報道MSI腫瘤多為女性，本研究沒有證實性別與其有關(guān)，因此對于MSI-H與性別是否有關(guān)尚存在爭議，有待進一步研究。 另外，值得注意的是有文獻[7]報道MSI腫瘤患者年齡分布具有特點，伴有MLH1超甲基化的患者與伴有MMR基因胚系突變的患者相比年齡較大，而后者則較年輕。在一些學(xué)者的研究[8]中表明MMR缺失的病例較少發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,這與本研究結(jié)果一致。還有些學(xué)者研究[9]表明MSI與腫瘤分期無關(guān)，但本研究顯示MSI-H病例多為Ⅱ期患者，這可能和散發(fā)性MSI-H結(jié)直腸癌異質(zhì)性更高，研究所選區(qū)域不能完全反映腫瘤整體，以及病例數(shù)量有關(guān)。

圖2 PCR-毛細管電泳法檢測

圖3 結(jié)直腸癌患者的OS生存曲線

本研究顯示不論任何一種組織學(xué)亞型的CRC，只要伴有MSI, 生存期均有所提高。有學(xué)者研究[10]顯示伴有MSI的II期CRC患者6年生存率為97%，因此，這些患者手術(shù)后不需要輔助化療。這些都提示MMR蛋白表達狀態(tài)與CRC預(yù)后密切相關(guān)，并且可以很好地解釋本研究結(jié)果中伴有MSI的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的減少。雖然MSI檢測是金標(biāo)準(zhǔn)，但IHC檢查MMR蛋白性價比較高，更易于患者接受，因此所有CRC患者特別是<60歲患者都應(yīng)進行篩查。IHC檢查MMR蛋白為患者病情轉(zhuǎn)歸和化療療效提供預(yù)測，影響患者治療策略的選擇，并提示Lynch綜合征，促進腫瘤的個體化治療。

伴有MSI的CRC之所以有良好的預(yù)后是因為腫瘤本身的組織學(xué)特點。腫瘤組織周圍以淋巴細胞為主的增強的炎癥反應(yīng)可能有助于生存時間的延長。目前本研究缺乏炎癥反應(yīng)方面的資料，但關(guān)于這一組織學(xué)特點的研究未來可能會成為研究的熱點。

有研究[11]顯示MMR蛋白缺失的Ⅲ期和Ⅳ期CRC患者發(fā)生腫瘤轉(zhuǎn)移的比例較低，并且OS顯著提高。散發(fā)性伴有MSI的CRC患者與染色體不穩(wěn)定(chromosomal instability,CIN)途徑發(fā)生CRC的患者相比預(yù)后較好。這一結(jié)果可能是由于p53和K-ras基因突變在伴有MSI的CRC較為少見。本研究的病例中，MSI患者以Ⅱ期腸癌為主，同時具有更長的總體生存時間，Ⅲ期和Ⅳ期患者相對較少，其中伴有MSI的病例則更少，因此微衛(wèi)星狀態(tài)對Ⅲ期和Ⅳ期CRC患者預(yù)后的影響了解較少。