KIF20A在胃癌中的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系

盛 燚，張尚鑫，閆 強(qiáng)，孫若川，李德關(guān)，魯明典，張 震，李永翔

1982年，KIF家族被首次發(fā)現(xiàn)存在于魷魚細(xì)胞中，隨后普遍在真核生物中檢出。研究[1]顯示KIF家族是一類具有軸突運(yùn)輸功能的分子馬達(dá)，參與細(xì)胞分裂。2005年，首次發(fā)現(xiàn)驅(qū)動蛋白家族成員20A(kinesin family member 20A, KIF20A)在胰腺癌中高度表達(dá)，在體外條件下用siRNA抑制胰腺癌細(xì)胞KIF20A的表達(dá)后，細(xì)胞的增殖被明顯抑制[2]。自此KIF20A在腫瘤中的作用開始倍受關(guān)注。體外研究[3]表明，一些KIF20A衍生肽能夠產(chǎn)生針對KIF20A陽性和HLA-A2陽性胰腺癌細(xì)胞的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞，從而識別并誘導(dǎo)癌細(xì)胞的死亡，而對正常細(xì)胞無細(xì)胞毒反應(yīng)，這表明了其在靶向治療上的可能性。不久之后，針對KIF20A在胰腺癌的I/II期臨床試驗(yàn)更是取得了令人滿意的成果[4-5]。簡而言之，KIF20A可能是一個十分有潛力的腫瘤標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。然而，KIF20A在癌細(xì)胞中的高度表達(dá)是否具有普遍性，及其在腫瘤中的生物學(xué)功能機(jī)制仍然是未知的。該研究通過檢測KIF20A在胃癌中的表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系，并調(diào)控其表達(dá)探究對胃癌細(xì)胞系增殖的影響，為胃癌的臨床預(yù)后評估和靶向治療提供新的方向。

1 材料與方法

1.1材料經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，以及患者知情同意并簽字后，于安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科收集胃癌患者的手術(shù)后腫瘤樣本。第一批樣本為37對胃癌組織及配對癌旁組織，取樣后加入RNA保存液，之后立刻儲存于-80 ℃冰箱，用qRT-PCR檢測表達(dá)。第二批樣本為122例患者術(shù)后胃癌組織和隨機(jī)選取的24例癌旁組織，取樣后用福爾馬林浸泡并石蠟包埋，制作成組織微陣列(TMA)，用免疫組化染色檢測表達(dá)。人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS來自上海生命科學(xué)院，用于細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)。

1.2主要試劑和方法

1.2.1主要試劑 TransZol Up RNA提取試劑盒購自北京Transgen公司；第一鏈cDNA合成試劑盒、熒光定量試劑盒購自瑞士Roche公司；RIPA裂解液、BCA蛋白定量試劑盒、鼠/兔二抗購自上海碧云天公司；鼠一抗購自美國Abcam公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；超級ECL發(fā)光試劑盒、KIF20A抗體購自美國Thermo Fisher公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素/鏈霉素和PBS溶液購自澳大利亞Gibco公司；siRNA-KIF20A購自美國Santa Cruz公司；CellTiter-Glo發(fā)光法細(xì)胞活性檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2.2實(shí)時熒光定量PCR(qRT-PCR) 按照TransZol試劑盒說明書提取總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，KIF20A正向引物5′-ACTTTGCGGCTATGCGAGGAT-3′，反向引物5′-TGAGAA GATGCTGTGACTGCG-3′，β-actin正向引物：5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′，反向引物: 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′。qRT-PCR的反應(yīng)條件包括: 95 ℃ 5 min預(yù)變性，然后按95 ℃ 10 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 15 s，共做45個循環(huán)，最后72 ℃ 5 min延伸。以β-actin作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對定量分析。

1.2.3Western blot實(shí)驗(yàn) RIPA法提取蛋白后按照BCA試劑盒說明書檢測蛋白濃度，配制20 μl蛋白量體系。經(jīng)SDS-PAGE膠電泳后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上。經(jīng)5%脫脂牛奶封閉1 h后，于4 ℃冰箱一抗(KIF20A按1 ∶1 000稀釋，β-actin按1 ∶3 000稀釋)孵育過夜。TBST洗3次，每次10 min，二抗(1 ∶3 000)孵育2 h，再次清洗后使用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯影。

1.2.4免疫組化 將組織切片進(jìn)行HE染色，觀察并取樣典型胃癌組織，制作為組織微陣列。將組織微陣列放入50 ℃烘箱，烘烤2 h，全自動染色機(jī)中脫蠟，乙醇脫水，超純水洗滌后檸檬酸抗原修復(fù)，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，滴加KIF20A一抗(1 ∶2 000)4 ℃冰箱過夜，PBS洗滌，滴加兔二抗，孵育1 h，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染后封片。使用兔血清替代一抗重復(fù)實(shí)驗(yàn)作為陰性對照。由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富的病理醫(yī)師對組織微陣列進(jìn)行判讀和評分，染色強(qiáng)度計分：無染色記0分，淺黃色記1分，棕黃色記2分，棕褐色記3分；陽性細(xì)胞數(shù)計分：0%記0分，<25%記1 分，25% ～ 75%記2分，>75%記3分。免疫活性計分(IRS)=染色強(qiáng)度計分×陽性細(xì)胞數(shù)計分。IRS≤2記為陰性，將IRS>2記為陽性，從而將所有樣本分為陰性和陽性兩組。

1.2.5細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 AGS細(xì)胞系采用混有10%胎牛血清和1%的抗生素(青霉素/鏈霉素)的RPMI-1640培養(yǎng)液。培養(yǎng)在5% CO2、37 ℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。待細(xì)胞系處于對數(shù)生長期，按照sc-91657說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，24 h后提取總RNA和蛋白并進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.6細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 成功轉(zhuǎn)染后，待細(xì)胞系處于對數(shù)生長期。細(xì)胞計數(shù)，制備密度為3×104個/ml的細(xì)胞懸液1 ml。分別取100 μl細(xì)胞懸液，以3 000個/孔的密度種植于96孔板中。培養(yǎng)72 h后，各孔中加入Cell Titer-Glo試劑20 μl，輕輕混勻后室溫靜置10 min，在多孔板酶標(biāo)儀上檢測獲取數(shù)據(jù)。

1.3統(tǒng)計學(xué)處理使用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。采用配對t檢驗(yàn)，驗(yàn)證KIF20A mRNA在胃癌及其癌旁組織中的表達(dá)情況。KIF20A表達(dá)高低與臨床病理特征的關(guān)系采用Pearson χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier方法制作生存曲線。采用Log-Rank檢驗(yàn)進(jìn)行臨床病理特征及KIF20A表達(dá)與總生存期間的單因素分析。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)來驗(yàn)證細(xì)胞系增殖的差異。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1KIF20A在胃癌中高表達(dá)為了研究胃癌中KIF20A基因表達(dá)情況，在37對胃癌及配對癌旁組織中檢測KIF20A mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其中27例胃癌患者的KIF20A基因在轉(zhuǎn)錄水平高于其癌旁組織(P<0.05)，見圖1。之后在包含了122例胃癌組織和24例隨機(jī)癌旁組織的組織微陣列中進(jìn)行免疫組化染色，可以發(fā)現(xiàn)KIF20A主要表達(dá)于胞質(zhì)中(圖2A)。如圖2B所示，根據(jù)免疫組化評分結(jié)果，胃癌組織中的KIF20A陽性表達(dá)(54.92%)明顯高于其癌旁組織(29.17%)(P<0.001)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分別從轉(zhuǎn)錄和翻譯水平驗(yàn)證了在胃癌中KIF20A表達(dá)均是上調(diào)的。

圖1 胃癌及其癌旁組織中KIF20A mRNA的相對表達(dá)

2.2KIF20A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系結(jié)合臨床病理資料，用χ2檢驗(yàn)來驗(yàn)證KIF20A基因表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系。表1顯示，KIF20A表達(dá)與胃癌病理分化有關(guān)(P=0.036)，但KIF20A與年齡、性別、腫瘤大小、腫瘤位置、腫瘤浸潤程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期無關(guān)。

表1 胃癌患者中KIF20A表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

圖2 胃癌組織及其癌旁正常組織中KIF20A的蛋白表達(dá)

A：免疫組化圖；a：KIF20A在胃癌組織中的陽性表達(dá)；b：KIF20A在胃癌組織中的陰性表達(dá)；c：KIF20A在癌旁正常組織中的陰性表達(dá)；1：×100；2：×200；B：免疫組化法檢測胃癌和正常組織KIF20A蛋白表達(dá)；與癌旁組織比較：*P<0.05

2.3KIF20A表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系采用Log-Rank檢驗(yàn)法分析了KIF20A表達(dá)與預(yù)后之間的關(guān)系。針對KIF20A表達(dá)在胃癌中的生存分析顯示，KIF20A高表達(dá)的胃癌患者總生存期為(40.16±24.65)月，相較于KIF20A低表達(dá)的胃癌患者(48.91±21.84)月明顯偏低(P=0.022)，見圖3。綜上所述，KIF20A可作為胃癌的一個獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險因子。

2.4KIF20A對AGS細(xì)胞增殖能力的影響鑒于KIF20A的高表達(dá)可能與胃癌進(jìn)展有密切關(guān)系，在體外水平探索KIF20A對胃癌細(xì)胞增殖能力的影響。利用siRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞系，并成功下調(diào)了KIF20A的表達(dá)(P=0.005)，見圖4A、4B。采用CellTiter-Glo法檢測AGS細(xì)胞系的增殖能力。如圖4C所示，在體外水平，下調(diào)KIF20A基因表達(dá)能明顯抑制AGS細(xì)胞增殖能力(P<0.001)。

圖3 Kaplan-Meier生存曲線 KIF20A表達(dá)與胃癌患者術(shù)后總生存期的關(guān)系

3 討論

作為驅(qū)動蛋白-6亞家族之一，KIF20A是一種微管相關(guān)馬達(dá)蛋白，其生物學(xué)功能主要參與細(xì)胞分裂，以及細(xì)胞器或細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)等細(xì)胞活動[6]。近期有越來越多的研究發(fā)現(xiàn)KIF20A的上調(diào)與癌癥相關(guān)。2005年，KIF20A被首次發(fā)現(xiàn)在胰腺癌中過表達(dá)，而在體外水平采用siRNA下調(diào)KIF20A基因表達(dá)后能抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖[2]。研究發(fā)現(xiàn)KIF20A在肝癌細(xì)胞中過表達(dá)，而正常肝細(xì)胞中KIF20A幾乎不表達(dá)，沉默肝癌細(xì)胞中KIF20A基因的表達(dá)會導(dǎo)致細(xì)胞染色體多倍體化，這種現(xiàn)象與KIF20A能夠促進(jìn)細(xì)胞分裂和增殖但不會誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的功能基本一致[7]。更有研究發(fā)現(xiàn)在正常組織中，KIF20A在胎兒肝臟、成人胸腺和骨髓中高表達(dá)，在胎盤和成人心臟中低表達(dá)，在成人腦、肺、肝、脾、腎、骨骼肌和淋巴中不表達(dá)[8]。此外，研究發(fā)現(xiàn)針對KIF20A的衍生肽可以誘導(dǎo)產(chǎn)生對胰腺癌細(xì)胞具有免疫殺傷功能的細(xì)胞毒T細(xì)胞，而對正常細(xì)胞幾乎無害[9]。隨之開展的針對KIF20A在胰腺癌的一些I/II期臨床實(shí)驗(yàn)中，也取得了成功。這些研究都說明了KIF20A很可能是癌癥中一個極有潛力的腫瘤治療靶點(diǎn)。但是其潛在的分子機(jī)制仍不十分清楚，而且KIF20A與胃癌的關(guān)系也不清楚。

本研究qRT-PCR和免疫組化顯示，相較于正常對照，胃癌中KIF20A在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均高表達(dá)，這提示了KIF20A在胃癌中可能扮演著促癌基因的作用。通過組織微陣列結(jié)果，結(jié)合臨床病理資料發(fā)現(xiàn)，KIF20A高表達(dá)與胃癌組織分化程度差顯著相關(guān)。結(jié)合胃癌患者隨訪資料，通過生存分析顯示，KIF20A高表達(dá)的胃癌患者總生存期更短。上述結(jié)果提示KIF20A的高表達(dá)可能是參與胃癌發(fā)展、遷移等過程的關(guān)鍵基因。在初步體外試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)沉默KIF20A的表達(dá)后，胃癌細(xì)胞的增殖能力受到明顯抑制，這為胃癌靶向治療提供了一個新的可能性。

本實(shí)驗(yàn)依然存在一些不足之處。首先，在生物學(xué)功能上，可以進(jìn)行細(xì)胞侵襲和遷移試驗(yàn)，來驗(yàn)證癌細(xì)胞KIF20A高表達(dá)是否能夠增強(qiáng)腫瘤的侵襲和遷移能力。其次，細(xì)胞死亡形式包括細(xì)胞凋亡、細(xì)胞壞死、細(xì)胞自噬和有絲分裂災(zāi)變等。而KIF20A在細(xì)胞分裂中占有重要地位，探索KIF20A在上述細(xì)胞死亡形式特別是有絲分裂災(zāi)變過程中是否具有重要作用以及怎樣的作用是我們進(jìn)一步的研究方向。

圖4 siRNA轉(zhuǎn)染AGS細(xì)胞后對細(xì)胞增殖的影響

A：轉(zhuǎn)染siRNA后KIF20A mRNA的表達(dá)降低；B：轉(zhuǎn)染siRNA后KIF20A蛋白的表達(dá)降低；C：轉(zhuǎn)染siRNA后AGS細(xì)胞增殖能力下降；與siRNA-NC組比較：*P<0.05

綜上所述，KIF20A在胃癌中高度表達(dá)，也是胃癌中一個獨(dú)立預(yù)后風(fēng)險因子。此外，沉默KIF20A抑制了胃癌細(xì)胞增殖，提示了KIF20A在胃癌中可能發(fā)揮著癌基因的作用，并很可能是一個新的胃癌治療靶點(diǎn)。進(jìn)一步研究其潛在分子機(jī)制，能夠?yàn)槲赴┑陌邢蛑委熖峁┬碌牟呗浴?/p>