胃癌組織中NEDD4L的表達及其臨床意義

蔣興旺，閆 強，張尚鑫，孫若川，李德關，魯明典，張 震，李永翔

胃癌發病率在我國連年居高不下，是我國第二大常見腫瘤[1]，要降低胃癌的總體死亡率，早期發現并及時治療是非常重要的，而早期胃癌并無明顯癥狀，多數患者就診時已是中晚期。手術治療是胃癌的首選治療方式，但對于中晚期患者，手術預后不佳。泛素化是人體內的蛋白質修飾系統，能夠介導膜蛋白、細胞周期調控因子、轉錄因子、癌蛋白和抑癌蛋白等底物蛋白的降解、穩定和重定位，該過程受到激活酶(E1s)、結合酶(E2s)及蛋白酶(E3s)的嚴密調控。泛素化在腫瘤發生發展的各方面都發揮著重要作用，該過程的紊亂可能會導致機體發生腫瘤或其他疾病[2]。

神經前體細胞表達發育下調樣基因4(neural precursor cell-expressed developmentally down-regulated 4 like，NEDD4L)又稱Nedd4-2，屬于E3泛素連接酶Nedd4家族，NEDD4L可作用于上皮鈉通道(ENaC)，協助維持體內鈉平衡、維持血壓等[3]。已有研究[4-5]表明NEDD4L在多種腫瘤中發揮重要作用，但其在胃癌中的作用尚不明確。該研究通過檢測胃癌組織、癌旁正常組織中NEDD4L的表達情況及其與胃癌患者的預后、分化程度、浸潤深度和TNM分期等臨床病理參數之間的關系，以分析其對臨床判斷胃癌預后的參考價值。

1 材料與方法

1.1病例資料胃癌組織標本中用于免疫組化的標本收集自2006年12月～2008 年9月醫院普外科手術切除組織，術后病理明確診斷為胃癌，均具有完整的病理與相關隨訪資料。共包含124例胃癌組織與25例隨機選取的癌旁正常組織(距腫瘤邊緣>5 cm)，將組織樣本制作成組織芯片，進行免疫組化檢測。其中男96例，女28例；年齡29～80歲，平均60.86歲，中位年齡60歲，≥61歲有63例，<61歲有61例；腫瘤直徑≥6 cm有83例，<6 cm有41例；淋巴結轉移陽性有83例，陰性有41例；腫瘤浸潤深度較淺的(T1和T2)有26例，較深的(T3和T4)98例；根據第七版AJCC (the American Joint Committee on Cancer)TNM分期標準，Ⅰ～Ⅱ期52例，Ⅲ～Ⅳ期72例。另收集2016年8～10月于安徽醫科大學第一附屬醫院普外科手術切除的25對新鮮胃癌及配對癌旁正常組織標本(距腫瘤邊緣>5 cm)，-80 ℃保存待用，所有患者均被告知并簽署知情同意書，實驗方案得到醫院倫理委員會審核及批準。

1.2主要試劑和儀器TRIzol(上海翊圣生物科技公司)；逆轉錄試劑盒、SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(日本Toyobo公司)；NEDD4L抗體(美國Proteintech Group公司)；二抗(上海碧云天生物技術公司)；Western blot 化學發光液(美國Millipore公司)。384孔PCR板；7900H型實時熒光定量PCR 儀(美國Applied Biosystems公司)。

1.3方法

1.3.1定量PCR 取適量胃癌和癌旁正常組織提取mRNA反轉成cDNA,以此作為模板進行定量PCR反應，以β-actin作為內參，NEDD4L F：5′-TCC AATGGTCCTCAGCTGTTTA-3′，R: 5′-ATTTTCCACG GCCATGAGA-3′；β-actin F：5′-CTCCATCCTGGCCTC GCTGT-3′，R: 5′-GCTGTCACCTTCACCGTTCC-3′，反應條件設置如下:95 ℃變性10 min，然后95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸40 s，以上三步進行40個循環。所用儀器為美國 Applied Biosystems(ABI)公司7900H型實時熒光定量PCR儀，使用384孔定量板作為反應容器，每個樣品重復3個復孔。目的基因的相對表達水平采用2-ΔΔCt法計算。

1.3.2Western blot 提取胃癌和癌旁正常組織中的總蛋白，然后經過上樣、電泳(80 V電泳30 min后換110 V電泳約1 h 30 min)、轉膜(0.3 A，1 h 30 min)、封閉(5%脫脂牛奶封閉液)、孵育(一抗稀釋比1 ∶1 000，二抗稀釋比1 ∶5 000)、顯影(AB液按1 ∶1配制)后，采用image J軟件分析目的條帶與β-actin的灰度值之比表示目的蛋白的相對表達水平。

1.3.3免疫組化 石蠟標本切成4 μm厚的切片，然后經過脫蠟、抗原修復、孵育一抗、孵育二抗、顯色、封片后，在顯微鏡下觀察，采用免疫反應積分法(IRS)[即染色強度(SI)與陽性細胞百分率(PP)的乘積評分。陽性細胞評分按陽性細胞占總細胞數的百分比例評分，分為四級：≤25%(1分)；26%～50%(2分)；51%～75%(3分)；>75%(4分)。染色強度評分，共四級，標準為：無色(-，0分)；淡黃色(+，1分)；棕黃色(++，2分)；棕褐色(+++，3分)。為便于分析結果，按IRS分數將結果分為兩組，分別為[IRS≤2，低表達(陰性)組]和[IRS>2，高表達(陽性)組]。

1.4統計學處理使用SPSS 17.0軟件進行數據分析，采用t檢驗進行組間均數比較，NEDD4L表達與臨床病理參數之間的分析采用Pearson χ2檢驗，生存曲線分析采用Kaplan-Meier法，并采用Log-Rank檢驗，采用Cox回歸模型進行多因素分析，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1NEDD4L在胃癌和癌旁正常組織中低表達定量PCR結果顯示，在多數(72%，18/25)的胃癌組織中，NEDD4L mRNA水平均明顯低于其對應的癌旁正常組織(P<0.05)；蛋白質免疫印跡法結果顯示NEDD4L在胃癌組織的平均灰度值(0.55±0.49)明顯低于癌旁正常組織(1.27±0.51)(t=0.012 5,P<0.01)，見圖1；免疫組化結果顯示NEDD4L蛋白主要定位于細胞質，見圖2，且NEDD4L在胃癌組織標本中的陽性率為45.97%(57/124)明顯低于癌旁正常組織標本的72%(18/25)(χ2=5.64,P<0.05)。

圖1 NEDD4L在胃癌組織(T)和癌旁組織(N)中mRNA和蛋白表達A、B：NEDD4L在胃癌組織和癌旁組織中mRNA的相對表達量；C：NEDD4L在8對(1～8)胃癌組織(T)和癌旁組織(N)中蛋白的相對表達量

圖2 胃癌組織和癌旁組織中NEDD4L的免疫組化結果 ×200

A：低分化胃癌組織；B：中分化胃癌組織；C：高分化胃癌組織；D：癌旁正常組織

2.2NEDD4L在胃癌組織中的表達與臨床病理參數之間的關系胃癌組織中NEDD4L蛋白的表達與分化程度(P<0.05)、浸潤深度(P<0.05)和臨床TNM分期(P<0.05)顯著相關，而與其他病理參數無顯著相關性，見表1。

2.3生存分析Kaplan-Meier生存分析表明浸潤深度、腫瘤大小、臨床TNM分期、分化程度、淋巴結轉移及NEDD4L的表達水平均與胃癌患者預后生存期相關，見表2；高表達NEDD4L的患者其平均生存時間(mean survival time,MST)要明顯高于低表達NEDD4L的患者(59.1個月vs37.7個月，P<0.001)，見圖3；單因素Cox回歸分析表明浸潤深度、腫瘤大小、TNM分期、分化程度、淋巴結轉移狀態以及NEDD4L的表達水平均與胃癌患者生存期密切相關；多因素Cox回歸模型分析結果表明NEDD4L的表達水平(HR=0.467，95%CI：0.260～0.838，P<0.05)是胃癌的獨立預后因素，見表3。

表1 胃癌組織中NEDD4L的表達與臨床病理參數之間的關系

表2 胃癌病理參數與患者預后關系的分析

3 討論

近年來有多項研究表明，NEDD4L在腫瘤的發展中扮演著重要角色。Hu et al[6]報道NEDD4L在前列腺癌組織中低表達，而且NEDD4L表達降低和腫瘤的侵襲性正相關。He et al[7]發現NEDD4L的下調在惡性腦膠質瘤中和腫瘤的侵襲性增強以及患者的不良預后相關。在肺癌以及肝癌也發現類似情況[8-9]。Gao et al[10]發現NEDD4L在胃癌組織中的低表達與患者的不良預后相關，但該研究樣本量相對較小，且未包含正常對照，臨床意義有限。

圖3 NEDD4L表達與胃癌患者術后生存期的生存曲線分析

本研究結果顯示NEDD4L在胃癌組織中的mRNA和蛋白質表達水平相對于癌旁正常組織明顯降低，提示NEDD4L基因的低表達或許參與胃癌發生過程；大樣本量組織芯片的免疫組化結果也顯示NEDD4L在胃癌組織中的表達明顯低于正常對照，臨床病理參數分析表明腫瘤分化程度、浸潤深度和臨床TNM分期均與NEDD4L蛋白的表達顯著相關，提示NEDD4L可能與胃癌細胞的增殖和侵襲密切相關，在胃癌發展中發揮重要作用；生存分析結果表明NEDD4L的下調與胃癌患者較短的生存期顯著相關，NEDD4L高表達是胃癌患者良好預后的獨立預測因子。

表3 臨床病理參數及患者預后的Cox回歸分析

本研究雖然探討了NEDD4L在胃癌和癌旁正常組織中的表達差異及NEDD4L表達與胃癌患者預后的關系，但是并沒有深入研究其作用的內在分子機制，關于NEDD4L在腫瘤中發揮作用的具體分子機制，目前相關報道有限，還有待進一步研究。

綜上所述，NEDD4L在胃癌組織中的表達與腫瘤組織分化程度、浸潤深度和臨床TNM分期負相關，而且NEDD4L高表達的胃癌患者預后較好，這表明NEDD4L在胃癌的發生發展中可能發揮著重要作用，隨著研究的深入，NEDD4L有可能作為胃癌診斷和治療的新靶標。