miR-133b對喉癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機制研究

郭有新，陳寶剛，劉建偉，李 立，張 紅，馬志紅

喉癌(laryngeal carcinoma, LC)作為常見的頭頸部惡性腫瘤，其主要病理類型為鱗狀細胞癌，目前認為其發病與吸煙、飲酒、環境因素、放射線、病毒感染及微量元素的缺乏相關[1-2]。根據我國2015年全國腫瘤登記中心(NCCR)最新公布的中國癌癥統計數據顯示：2015年新發惡性腫瘤約429萬例，死亡人數約281萬；其中喉癌新發病例約2.64萬，死亡人數約1.45萬例[3]，嚴重威脅人類的生命與健康。miRNA作為一類高度保守的非編碼單鏈小RNA，已證實其通過轉錄后調控參與影響幾乎所有的生理、病理進程，在多個物種中發揮重要作用[4-5]。不少miRNA被發現在喉癌發生過程中發揮著促進或者抑制的調節功能[6-7]，但大部分miRNA在喉癌轉移過程中的調控機制目前尚不明確。該研究探討miR-133b對喉癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及機制。

1 材料與方法

1.1細胞及主要試劑總RNA抽提試劑TRIzol購自美國Invitrogen公司；hsa-miR-133b mimics/NC、轉染試劑riboFECTTM CP Reagent、hsa-miR-133b real-time PCR引物購自廣州市銳博生物科技有限公司；逆轉錄試劑盒Reverse Transcription System、SYBR?PrimeScriptTMRT-PCR Kit試劑盒、mRNA SYBR Green熒光定量PCR試劑購自日本TaKaRa公司；Propidium Iodide/碘化丙啶、RNase A、MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；喉癌Hep-2細胞購自北京協和基礎研究所細胞中心。

1.2方法

1.2.1胃癌差異表達miRNA篩選 本研究基于GEO數據庫下載并獲取喉癌組織miRNA芯片高通量數據集GSE47610(GSM1153144- GSM1153148)，其中包括3例喉癌組織樣本與2例正常喉組織。本研究主要采用的生物信息學分析工具為Qlucore Omics Explorer (QOE)3.2，由瑞典隆德大學研制，一種新型的生物信息學分析軟件，可用于分析基因芯片、基因表達、實時PCR以及DNA甲基化等多種生物學數據。

1.2.2實時定量PCR檢測喉癌組織miR-133b表達量 選取河北省承德市醫學院第二附屬醫院2015年6月～2017年6月收治的46例喉癌患者為研究對象，手術切除的喉癌組織標本為喉癌組，遠離腫瘤的正常喉組織標本為對照組。TRIzol法提取組織總RNA，取10 μl RNA進行逆轉錄，采用U6作為內參進行相對定量分析，定量反應體系按照12.5 μl SYBR Premix Ex Taq，1 μl PCR Forward Primer, 1 μl Uni-miR qPCR Primer，2 μl cDNA模板，8.5 μl ddH2O，總體積為25 μl，每個樣品設置3個平行孔。擴增程序為：預變性95 ℃、30 s；95 ℃、5 s，60 ℃、20 s，40個循環；采用2-ΔΔCt法計算miR-133b的相對表達量。

1.2.3轉染hsa-miR-133b至Hep-2細胞及轉染效率檢測 培養并接種1×105個Hep-2細胞至含有適量完全培養基的24孔培養板中，使轉染時的細胞密度達到30%～50%。用 30 μl 1× riboFECTTMCP Buffer稀釋1.25 μl 20 μmol/L hsa-miR-133b mimic，輕輕混勻。加入3 μl riboFECTTM轉染試劑，輕輕吹打混勻，室溫孵育15 min。將培養板置于 37 ℃的CO2培養箱中培養24 h。熒光顯微鏡檢測轉染效率。其中，轉染hsa-miR-133b NC設為對照組。

1.2.4MTT法檢測細胞增殖 將過表達miR-133b組及NC組Hep-2細胞穩定培養后傳代于96孔板，完全培養基培養，分別于24、36、48、72 h進行MTT檢測。每組4個重復。96孔板每孔加入20 μl MTT (5 mg/ml PBS溶解)，孵育4 h然后棄除上清液。每孔里面再加入150 μl Formazan溶解液，振蕩10 min，充分溶解結晶物。酶標儀(490 nm)測定光吸收值。

1.2.5流式檢測細胞周期 將過表達miR-133b組及NC組Hep-2細胞穩定培養后傳代，完全培養基培養至24 h，用胰酶消化收集細胞，加入1 ml 75%預冷乙醇中，吹打均勻，4 ℃固定12 h以上，再加入PBS洗滌，離心1 000 r/min，5 min，清洗兩次。重懸細胞用0.5 ml PBS，每孔加入PI和 RNaseA至終濃度50 μg/ml，37 ℃溫浴30 min。流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.6流式檢測細胞凋亡 懸浮兩組細胞離心(2 000 r/min離心5 min)收集，貼壁細胞用不含EDTA的胰酶消化收集，用PBS洗滌細胞兩次(2 000 r/min離心5 min)收集5×105細胞，，加入500 μl的緩沖液懸浮細胞，加入5 μl Annexin V-EGFP混勻后，加入5 μl碘化丙啶，混勻，室溫避光反應15 min，用流式細胞儀進行檢測。

1.2.7細胞侵襲實驗 將凍存于-80 ℃冰箱的BD matrigel 4 ℃過夜(24 h)，變成液態，取300 μl無血清培養基，加入60 μl Matrigel，混勻，加入上室各100 μl，放入37 ℃培養箱中，孵育4～5 h，此間經常觀察，當出現“白色層”時，說明已經變為固態。用無血清培養基洗Matrigel 1次，每孔加入100 μl兩組細胞懸液，下腔室中加入500 μl含有20%FBS條件培養基，37 ℃培養箱中孵育24 h，取出Transwell用PBS洗2遍，5%戊二醛固定(4 ℃)，加入結晶紫(0.1%)染色10 min，室溫0.5 h，PBS洗2次，用棉球擦去上表面細胞，顯微鏡下觀察。

1.2.8雙熒光素酶載體法驗證miR-133b靶基因 通過雙熒光素酶報告基因檢測系統，分別構建帶有野生型和突變型GSTP1-3’UTR的報告載體pLUC；將hsa-miR-133b mimic、NC分別與pLUC- GSTP1-Mut、pLUC- GSTP1-WT共轉染到293T細胞中，測定螢火蟲熒光素酶相對活性。

1.2.9Western blot檢測GSTP1蛋白 將過表達miR-133b組及NC組Hep-2細胞穩定培養后傳代，完全培養基培養至24 h，提取兩組細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，沸水變性，配制10%的分離膠及5%的濃縮膠，SDS-PAGE電泳；轉膜后，加入用封閉液稀釋的相應一抗，室溫搖床孵育2 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；再加入用封閉液稀釋的相應二抗室溫搖床孵育1 h，并用TBS洗膜3次，每次15 min；ECL顯色檢測。

2 結果

2.1喉癌表達miRNAs的篩選基于GEO獲取的喉癌組織miRNA芯片高通量數據，根據設定的數值過濾標準和中位值標準化處理，對表達差異miRNAs進行分層聚類分析，獲得5個表達上調miRNA，8個表達下調miRNA，見圖1。通過數據分析及前期實驗室研究成果，選擇miR-133b進行功能研究。

2.2miR-133b在喉癌中差異表達及臨床特征關系采用Real-time PCR法檢測miR-133b在23例喉癌組織和對應23例癌旁正常喉黏膜組織的表達，結果表明喉癌組織標本中miR-133b表達顯著下調約4.1倍，差異有統計學意義(P<0.0001)，見圖2。此外，針對23例喉癌組織臨床特征分析，表明miR-133b的表達水平與腫瘤局部浸潤深度、是否存在區域淋巴結轉移、患者臨床分期以及組織學分級呈負相關，不同期別之間的差異有統計學意義，見表1。以上結果提示miR-133在喉癌的發生發展中可能具有關鍵的生物學作用。

圖1 喉癌表達miRNAs的篩選

圖2 hsa-miR-133b在喉癌組織中差異表達

2.3過表達miR-133b抑制喉癌細胞的增殖采用帶有Cy3熒光蛋白的hsa-miR-133b mimic轉染喉癌Hep-2細胞24 h后，熒光顯微鏡觀察大致轉染效率超過80%，見圖3A。同時，Real-time PCR法檢測miR-133b表達情況，結果表明相對于對照組，轉染組miR-133b表達升高至30倍(P<0.0001)，見圖3B，表明轉染成功。MTT法檢測過表達miR-133b喉癌Hep-2細胞增殖情況，結果顯示隨著培養時間增加至72 h，miR-133b表現出顯著性抑制喉癌增殖效果，尤其在48 h和72 h，抑制率達到(29.32±2.04)%和(34.81±2.76)%，見圖3C。

表1 miR-133b表達與喉癌患者臨床特征的關系

圖3 過表達miR-133b抑制喉癌細胞的增殖

A：熒光顯微鏡觀察采用帶有Cy3熒光蛋白的hsa-miR-133b mimic轉染效率；B：Real-time PCR法檢測轉染hsa-miR-133b 24 h后miR-133b表達情況；C：MTT法檢測過表達miR-133b、NC喉癌Hep-2細胞增殖；與NC組比較：****P<0.000 1

2.4過表達miR-133b影響喉癌細胞周期通過流式技術PI單染法檢測過表達miR-133b組及NC組細胞周期，結果顯示相對于對照組，miR-133b過表達組S期細胞數量明顯增多，說明細胞發生S阻滯，DNA合成受阻，細胞生長停滯，數量減少，見圖4。

圖4 過表達miR-133b影響喉癌細胞周期A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

2.5過表達miR-133b促進喉癌細胞凋亡通過流式技術檢測過表達miR-133b組及NC組細胞凋亡，結果顯示對照組細胞凋亡率為(6.82±0.65)%，miR-133b過表達組凋亡率為(16.47±1.92)%，表明過表達miR-133b促進喉癌Hep-2細胞凋亡，差異有統計學意義(P=0.001 2)，見圖5。

2.6過表達miR-133b抑制喉癌細胞侵襲通過Transwell小室侵襲實驗來檢測細胞的侵襲轉移能力，結果顯示對照組細胞侵襲數目為(452±36)，miR-133b過表達組細胞侵襲數目為(116±13)，表明過表達miR-133b顯著抑制喉癌Hep-2細胞侵襲，差異有統計學意義(P=0.000 1)，見圖6。

2.7miR-133b靶基因GSTP1的預測與驗證使用TargetScan數據庫對miR-32進行靶基因預測，從預測結果中挑選GSTP1等候選基因進行實驗。通過雙熒光素酶報告基因檢測系統，分別構建帶有野生型和突變型GSTP1-3’UTR的報告載體pLUC；將hsa-miR-133b mimic及NC分別與pLUC-GSTP1-Mut、pLUC-GSTP1-WT共轉染到293T細胞中，通過測定螢火蟲熒光素酶相對活性，結果表明hsa-miR-133b可以顯著降低pLUC-GSTP1-WT中hRluc表達(P=0.043)，并且針對pLUC-GSTP1-Mut沒有作用，見圖7。說明miR-133b可以通過GSTP1-3’UTR結合位點調控hRluc的表達，進而表明其存在靶向調控的關系。

圖5 過表達miR-133b促進喉癌細胞凋亡A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

圖6 過表達miR-133b抑制喉癌細胞遷移 ×200A:NC組;B:hsa-miR-133b mimic組

2.8過表達miR-133b降低靶基因GSTP1表達Western blot檢測過表達miR-133b組及NC組GSTP1蛋白表達，結果顯示過表達hsa-miR-133b可以明顯下調GSTP1蛋白表達量(P=0.013)，見圖8。

圖7miR-133b靶基因GSTP1的預測與雙熒光素酶報告基因驗證

與NC組比較：*P<0.05

圖8 過表達miR-133b降低靶基因GSTP1表達與NC組比較：*P<0.05

3 討論

隨著以miRNA為代表非編碼RNA在腫瘤領域研究的不斷深入，越來越多的喉癌相關miRNA被發現深度參與其發生發展治療過程中。Shen et al[8]用亞硫酸氫鹽測序技術針對104個喉癌組織及對應癌旁組織進行miR-34a啟動子區域CpG6位點DNA甲基化水平測序，結果表明喉癌組織中miR-34a啟動子甲基化程度顯著高于對照組，此外，通過Kaplan-Meier存活曲線分析表明miR-34a啟動子高甲基化與總生存率差相關(Log-Rank檢驗，P<0.05)。Liu et al[9]研究發現miRNA-125a在喉癌組織和喉癌干細胞Hep-2-CSCs中低表達，且miRNA-125a可以通過靶向調控造血細胞特異性相關X-1逆轉喉癌干細胞的順鉑抗性，過表達miRNA-125a后，發現細胞對多柔比星、依托泊苷、長春新堿的耐藥性大大提升。Zhou et al[10]研究表明miR-632在喉癌組織和喉癌細胞系中均表現為明顯上調表達，且其促進細胞增殖和克隆形成，促進細胞遷移和侵襲，增強細胞增殖相關蛋白、cyclinD1和c-myc表達，且Pearson相關分析顯示miR-632表達與喉癌組織中GSK3 mRNA表達呈負相關。這些異常表達miRNA發揮喉癌癌基因或抑癌基因作用，有望作為喉癌的早期診斷的新標志物，某些miRNA更有望可以作為喉癌的新治療靶點。

本研究前期基于GEO獲取的喉癌組織miRNA芯片高通量數據，分析差異表達miRNA并選擇miR-133b進行功能研究。首先，收集喉癌組織樣本，檢測表明喉癌中miR-133b表達顯著下調約4.1倍，且miR-133b的表達水平與腫瘤局部浸潤深度、是否存在區域淋巴結轉移、患者臨床分期以及組織學分級呈負相關，提示miR-133b在喉癌的發生發展中可能具有關鍵的生物學作用。其次，轉染hsa-miR-133b mimic轉染喉癌Hep-2細胞，實現細胞水平過表達miR-133b。本研究通過細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞侵襲等實驗表明過表達miR-133b可以顯著抑制喉癌細胞的增殖、影響喉癌細胞周期、促進喉癌細胞凋亡以及抑制喉癌細胞遷移，提示miR-133b在喉癌發展中扮演了抑癌基因的角色。最后，考慮到miRNA作為一種內源性非編碼RNA，其發揮功能方式主要通過完全或者部分互補結合靶基因3’非翻譯區影響靶mRNA穩定性，甚至降解mRNA，從而實現轉錄后水平調節靶基因的表達。通過生物信息學預測，筆者發現GSTP1是miR-133b潛在靶基因之一，通過雙熒光素酶報告基因實驗明確其之間確實存在關系，且過表達hsa-miR-133b可以明顯下調GSTP1蛋白表達量，意味著miR-133b可能是通過調控GSTP1來發揮其在喉癌中的作用。

谷胱甘肽轉移酶Pl(glutathione S-transferase pi, GSTP1)，基因定位于染色體的1lql3，該基因全長約3 bp，包括6個內含子和7個外顯子，編碼210個氨基酸，屬于谷胱甘肽S-轉移酶(glutathione S-transferases, GSTs)。GSTs能催化谷胱甘肽與親電子物質發生反應，對芳香族化合物具有較高降解性[11]。諸多研究[12]表明GSTP1在預防腫瘤發生的過程中起重要作用，但同時也是腫瘤細胞對化療藥物耐受的原因，并與許多耐藥相關基因在腫瘤中共表達。在膀胱癌研究中，唐榮金 等[13]通過慢病毒表達系統，建立穩定低表達GSTPl基因的膀胱癌細胞T24細胞株，發現GSTPl表達下調抑制T24細胞增殖，并其機制可能與促進T24細胞凋亡相關。在喉癌研究中，周建榮[14]通過建立人喉鱗癌組織及其癌旁正常黏膜組織的雙向凝膠電泳圖譜，識別鑒定其差異表達的蛋白質，結果表明GSTP1在喉癌中表達上調，這與本研究中miR-133b在喉癌中表達下調，且通過靶向結合GSTP1發揮作用一致。近年來發現GSTP1多態性與腫瘤的易感性關系密切，有研究通過meta分析GSTP1基因啟動子區甲基化檢測在前列腺癌臨床診斷中的意義，發現前列腺癌GSTP1基因啟動子區相比正常對照組呈現顯著高甲基化，差異有統計學意義(OR=17.98, 95%CI:12.16～26.58,P<0.000 1)，不同亞組間差異無統計學意義[15]。Matthias et al[16]發現GSTP1基因型頻率在喉癌與對照中的分布情況差異有統計學意義，該基因多態性可能與喉癌的遺傳易感性存在關聯。

綜上所述，本研究表明miR-133b通過GSTP1對喉癌Hep-2細胞增殖、凋亡、侵襲行為的影響及其對腫瘤局部浸潤深度、是否存在區域淋巴結轉移、患者臨床分期以及組織學分級呈負相關等臨床意義，為將來基于miR-133b進行喉癌臨床診斷、預后判斷及分子靶向治療提供新的思路和理論依據。