SLC26A3與NHERF4在潰瘍性結腸炎小鼠腸道組織中的動態表達研究

楊奉天，王 艷，黃俊凱，李 婉，徐麗紅

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種慢性復發性的腸道炎癥性疾病，近年因其逐年增高的發病率而成為消化系統疾病的研究熱點[1]。UC發病機制復雜，腸黏膜屏障及細胞屏障功能受損是其發病的重要機制之一[2]。溶質載體26A3(solute carrie 26A3，SLC26A3)是哺乳類動物腸上皮細胞頂端膜上主要Cl-/HCO3-離子轉運體[3]，其功能缺陷所引起的HCO3-分泌減少及Cl-吸收異?？梢詫е吗つて琳系姆€定性下降[4]，已有研究[5]證實UC患者中存在SLC26A3的表達缺陷，但其發生機制并不清晰。鈉氫交換體調節因子4(sodium/proton exchanger regulatory factor 4，NHERF4)是主要表達在腸道中的PDZ結構域蛋白(PDZ-domain proteins)[6]，既往細胞學研究[7]顯示NHERF4可負性調控SLC26A3的表達，NHERF4可能在UC發展中參與調控SLC26A3的表達，但目前尚無文獻證實NHERF4在UC中的表達改變。該研究利用惡唑酮(Oxazolone，OXZ)法制備C57BL/6J小鼠結腸炎動物模型，觀察其遠端結腸中SLC26A3和NHERF4 mRNA和蛋白的動態表達，初步評估NHERF4/SLC26A3是否參與UC的發生發展。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 48只雌性SPF級C57BL/6J小鼠由新疆自治區實驗動物研究中心提供。6周齡，體質量16～18 g，狀態優良，常規飼養。

1.1.2主要試劑與儀器 OXZ致敏劑(生產編號：MKBS4435V)購自美國Sigma公司；細胞漿蛋白與細胞膜蛋白提取試劑盒購自北京碧云天公司；RIPA總蛋白提取試劑盒購自北京索萊寶公司；SLC26A3 Western blot抗體(編號：sc-376187)購自美國Santa公司；NHERF4 Western blot抗體(編號：ab182507)購自美國Abcam公司；β-actin抗體、山羊抗小鼠及山羊抗兔抗體購自北京中杉金橋公司；熒光定量PCR試劑盒購自德國Qiagen 公司；cDNA合成試劑盒、低溫高速離心機、紫外分光光度計購自美國Thermo公司；Bio-RAD電泳儀、轉膜儀購自美國BIO公司；SLC26A3、NHERF4基因引物設計、合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1OXZ法建立C57BL/6J小鼠結腸炎模型 48只C57BL/6J小鼠稱重后按質量順序編號，隨機數表法分為對照組(n=24)與實驗組(n=24)。實驗組小鼠腹腔注射60 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，背部備皮，4% OXZ(100%乙醇溶劑)1 ml溶液涂抹2 d，第7天戊巴比妥鈉麻醉后，直腸灌注質量分數為1%的OXZ(50%乙醇溶劑)0.3 ml。對照組小鼠無水乙醇1 ml背部涂抹，直腸灌注50%酒精溶液0.3 ml。保留灌腸30 min后拔出灌腸器。

1.2.2采用UC疾病活動指數(disease activity index，DAI)評價小鼠結腸炎嚴重程度 在造模過程中，每日測量并記錄小鼠體質量、糞便含水、大便性狀、大便潛血和血便等指標。DAI評分參考Sutherland et al[8]標準：隱血實驗陰性且糞便成形0分；糞便松散不粘附肛門，若隱血陰性1分，陽性2分；糞便液態且隱血陽性3分；肉眼血便4分。

1.2.3病理組織學觀察小鼠結腸黏膜炎癥情況 根據DAI變化趨勢，選取第6、8、10、14天作為小鼠結腸炎活動前期、活動期、恢復期的時間節點(該實驗數據來源于前期預實驗)，留取組織標本。1%戊巴比妥鈉60 mg/kg 腹腔注射麻醉小鼠，取遠端結腸1/3(約距肛口1 cm)，剪開結腸后4 ℃生理鹽水沖洗干凈，4%甲醛溶液固定24 h后石蠟包埋，切片，經二甲苯脫蠟和乙醇水化，蘇木精-伊紅染色，乙醇水化，晾干后封片，行組織病理學觀察。

1.2.4qRT-PCR 檢測小鼠腸組織SLC26A3與NHERF4的mRNA水平 ① 分別于實驗進行第6、8、10、14天，將小鼠麻醉后剖腹，取距肛口1 cm內結腸組織;② 用TRIzol 法提取結腸組織的總RNA，紫外分光光度計測量總RNA的濃度與純度，選取吸光度值(optical density，OD) 260 nm/OD280 nm的值在1.8～2.0范圍內，按照cDNA合成試劑盒說明書進行逆轉錄;③ SLC26A3上游引物序列為：5′-TTCCCCTCAACAACATCACCATCC-3′，下游引物：5′-GTCTGCCTTGTGGTTGTCCT-3′；NHERF4上游引物序列為：5′-TTCACTCACAACCAACTCACCAG-3′，下游引物：5′-CAGGAACTGTCCAGGGCGAC-3′；β-Actin上游引物：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′;④ 采用熒光定量PCR試劑盒在64孔ABI Prism 7300序列檢測系統進行檢測。內參基因與目的基因各重復3次，同時設3個陰性對照，建立總體積為20 μl的反應體系，反應條件為：95 ℃、2 min(1個循環)；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s(40個循環)，循環結束后得到擴增曲線；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、30 s，60 ℃、15 s后得到溶解曲線。

1.2.5Western blot觀察SLC26A3及NHERF4蛋白的定量表達 液氮保存標本，取出，根據試劑盒說明書分別提取膜蛋白及總蛋白，測蛋白濃度，5×上樣緩沖液混勻后煮沸8 min使蛋白變性。SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%牛血清(BSA)洗滌，緩沖液(TBST)室溫封閉2 h，5% BSA的TBST稀釋SLC26A3(1 ∶100)和NHERF4(1 ∶1 000)抗體，β-actin(1 ∶1 000)作為內參，4 ℃過夜。洗膜后5% BSA的TBST稀釋抗兔和抗鼠的二抗(均為1 ∶10 000)37 ℃孵育2 h，洗膜后顯色，暗室內膠片曝光。采圖后Gel-pro軟件圖像數據分析灰度值。

2 結果

2.1小鼠糞便含水量、體質量、DAI變化趨勢

2.1.1糞便含水量 小鼠糞便含水量呈現先增高后減少的趨勢。實驗組在第8天糞便含水量明顯增高，第10天達到高峰。實驗組第8天糞便含水量(69.92%±5%)較實驗開始時增高(40.47%±6.5%，P<0.05)，在第10天最高(95.56%±2.3%)，對照組第8天的糞便含水量(49.2%±4%)與實驗開始時變化不顯著(40.92%±13%，P>0.05)，見圖1。

圖1 小鼠糞便含水量變化

2.1.2小鼠體質量 實驗組體質量先升高后減少。實驗組體質量于第8天開始明顯下降[(17.65±1.04) g]，較實驗組第7天明顯下降[(18.73±0.7) g，P<0.05]，對照組第8天體質量[(16.25±0.5) g]與實驗開始時[(16.24±0.4) g，P>0.05]比較，變化不顯著，見圖2。

圖2 小鼠體質量變化趨勢

2.1.3小鼠DAI變化趨勢 實驗組在第8天出現大便不成形，且部分出現肉眼血便，其第8天DAI評分(1.26±0.26)較實驗開始時(0.42±0.21)明顯增高(P<0.05)，且高于同期對照組DAI評分(0.94±0.3，P<0.05)，其第14天DAI評分(2.3±0.8)較第10天 (2.61±0.4)下降，但仍高于對照組第14天的DAI評分(0.2±0.1)，見圖3。即實驗組DAI評分在第8天開始上升，第10天達到峰值，第14天下降，呈先上升后降低趨勢。

圖3 小鼠DAI變化趨勢

2.2結腸黏膜組織學觀察結腸黏膜大體組織學觀察：實驗組第8天出現遠端結腸黏膜紅腫、充血，部分結腸黏膜表面可見膿苔附著，并有潰瘍形成，病變以中遠段結腸為主，同期對照組遠端結腸黏膜僅輕微水腫，無糜爛，無潰瘍形成。結腸黏膜顯微鏡下病理組織學觀察：對照組各時間點結腸黏膜無異常炎性細胞浸潤；實驗組第6天結腸黏膜與對照組相似，實驗組第8天及第10天結腸黏膜可見上皮細胞脫落，正常杯狀細胞減少、萎縮，淋巴細胞浸潤，可見隱窩膿腫，炎癥局限于黏膜和黏膜下層，實驗組第14天結腸黏膜未見明顯腸上皮細胞缺失，正常杯狀細胞較前增多，炎細胞減少，見圖4，箭頭所指為隱窩內膿腫。提示實驗組小鼠結腸黏膜病理組織學改變與人UC結腸黏膜病理組織學改變相似。

2.3小鼠腸道組織的SLC26A3mRNA表達水平與對照組比較，實驗組小鼠腸道組織的SLC26A3 mRNA的表達降低，且實驗組第8 、10天表達均低于同期對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。小鼠腸道組織NHERF4 mRNA的表達，實驗組第8天表達高于同期對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.4SLC26A3與NHERF4的蛋白表達Western blot檢測SLC26A3蛋白定量表達的結果顯示，與同期對照組比較，實驗組各時間點結腸黏膜中SLC26A3的表達均降低，其中以第10天差異最為顯著(對照組第10天vs實驗組第10天：0.83±0.05vs0.13±0.01，P<0.05)；同時在實驗組炎癥進展、恢復過程中，以第10天 SLC26A3表達水平最低(第10天vs第6天：0.13±0.01vs0.76±0.03，P<0.05；第10天vs第14天：0.13±0.01vs0.31±0.04，P<0.05)，見圖5，即小鼠腸黏膜中SLC26A3表達在炎癥活動期降低的更為明顯。Western blot檢測NHERF4蛋白定量表達的結果顯示，與同期對照組比較，實驗組各時間點結腸黏膜中NHERF4的表達明顯增高，其中以第8天差異最為顯著(對照組第8天vs實驗組第8天：0.23±0.004vs0.56±0.02，P<0.05)；同時在實驗組炎癥進展、恢復過程中，以第8天的表達水平最高(第8天vs第6天：0.56±0.02vs0.32±0.02，P<0.05；第8天vs第14天：0.56±0.02vs0.34±0.02，P<0.05)，見圖5，提示在活動期結腸黏膜中NHERF4的表達明顯上升。盡管實驗組第14天結腸黏膜中NHERF4的表達水平開始下降，但與同期對照組比較，其表達水平仍明顯增高(實驗組第14天vs對照組第14天：0.34±0.02vs0.20±0.02，P<0.05)，這可能與腸道黏膜細胞功能尚未完全恢復有關。

2.5NHERF4、SLC26A3與DAI在疾病發展過程中的相關性分析實驗組DAI評分先增高后降低，在第10天出現峰值，隨后進入炎癥減輕階段，直至第14天DAI評分呈逐漸下降趨勢，同時，實驗組腸黏膜中SLC26A3的降低與DAI評分的升高同步出現，并維持至DAI評分最高時，在后期DAI評分逐漸降低時，其表達呈緩慢上升趨勢，即SLC26A3的表達與DAI評分呈相反的趨勢，呈先降低后增高。NHERF4的表達與DAI評分呈相似的趨勢，先增高后降低，但在DAI評分開始上升時NHERF4表達處于峰值，而后期DAI評分最高時，NHERF4表達呈逐漸下降趨勢。本組結果提示，在腸道炎癥的進展恢復過程中始終伴隨著SLC26A3和NHERF4的表達改變，且NHERF4的表達升高可能先于腸道炎癥癥狀的出現。見圖6。

圖4 小鼠結腸炎模型HE染色 ×400

A：實驗組6 d；B：實驗組8 d；C：實驗組10 d；D：實驗組14 d；E：對照組6 d；F：對照組8 d；G：對照組10 d；H：對照組14 d

表1 腸道組織SLC26A3 mRNA、NHERF4 mRNA水平比較

與對照組比較：*P<0.05

圖5 動物模型實驗SLC26A3/NHERF4的表達

A：實驗組6 d；B：實驗組8 d；C：實驗組10 d；D：實驗組14 d; E：對照組6 d；F：對照組8 d；G：對照組10 d；H：對照組14 d

3 討論

UC是一種以結腸黏膜層和黏膜下層損傷為主的慢性炎癥性腸道疾病[9]，腸黏膜屏障功能缺陷及腸上皮細胞屏障功能減退在UC發病中具有重要作用[2,10-11]。

既往研究[12-13]顯示，SLC26A3是在腸道豐富表達的Cl-/HCO3-交換體。腸黏膜化學屏障是一種主要由黏蛋白構成的網狀膠體，分泌型黏蛋白2(mucin 2, MUC2)是其主要成分[4]。相關報道顯示，UC中存在SLC26A3的表達異常，其功能缺陷可引起MUC2表達異常，繼而導致屏障穩定性的下降及腸黏膜屏障功能的減退[4]，使腸道菌群得以與腸上皮細胞密切接觸[2]，引起腸道炎癥的發生，即SLC26A3的功能缺陷與UC的疾病發展密切相關。本研究與既往文獻[5]的研究結果相似，在腸道炎癥進展過程當中，SLC26A3確實存在有表達缺陷，但本研究還表明，SLC26A3在腸道炎癥活動期的表達低于疾病前期、恢復期及正常小鼠SLC26A3的表達，具體表現為SLC26A3的表達與小鼠腸道炎癥程度、腹瀉等變化一致，提示在腸道炎癥進展過程中SLC26A3表達的改變不僅與炎癥活動度有關，還與腹瀉癥狀有關；并且黏膜屏障損傷與UC患者腸黏膜恢復后臨床癥狀持續存在有關[14]，SLC26A3的正常表達與腸黏膜屏障相關[4]，從而推測SLC26A3表達的異?？赡芘cUC患者腸黏膜恢復后臨床癥狀持續存在具有一定相關性，但這一結論還需要進一步的實驗進行驗證分析。

圖6 SLC26A3、NHERF4蛋白表達趨勢與DAI評分趨勢

A：實驗組6 d；B：實驗組8 d；C：實驗組10 d；D：實驗組14 d

鈉氫交換體調節因子(sodium/proton exchanger regulatory factor，NHERF)蛋白家族是在上皮細胞中豐富表達的PDZ結構蛋白[15]，其亞型NHERF4可與胃腸上皮的多種轉運體相互作用，尤與SLC26A3的結合最強，并負性調控SLC26A3在細胞膜處的表達[6-7]，在UC發展過程中，SLC26A3的降低與NHERF4的表達可能具有相關性，但未見NHERF4在UC中表達的相關研究。本研究結果首次證實，在結腸炎模型小鼠處于疾病活動期時確實存在腸黏膜中NHERF4的表達明顯增高。此外，本研究結果還顯示，NHERF4的表達升高可能先于腸道炎癥癥狀的出現，并隨炎癥恢復其表達水平呈略落后的逐漸降低，提示NHERF4可能可作為判斷UC發展的預測指標。同時，通過比較分析NHERF4、SLC26A3和DAI在疾病發展過程中的相關性，本研究結果顯示，在腸道炎癥發展過程中，SLC26A3的表達降低與NHERF4的表達增高是相伴隨而存在的，且NHERF4與SLC26A3的降低增高在時間點上具有一定的重合性， UC中可能存在NHERF4對SLC26A3表達的負向調控，但該結論仍需進一步的干預實驗進行驗證。

本研究結果不僅為進一步研究UC發展過程中SLC26A3表達改變的機制提供了前期實驗數據和新的思路，同時，若本研究結果能夠得到進一步證實，還可為UC的治療提供新的靶點，如通過使用下調NHERF4或阻斷NHERF4與SLC26A3結合的藥物來改善腸黏膜中SLC26A3的表達，為減輕UC患者臨床癥狀和復發提供新的治療方案。