Wnt/β-catenin信號通路對小鼠海馬神經干細胞的影響

張先虎，朱俊德，龍婷婷，王俊婕，康朝勝

我國每年死于腦血管和神經系統疾病的患者約130萬，在我國致死和致殘原因中均名列第一[1]。因此，如何治愈或延緩腦血管和神經系統病變成為亟需解決的問題。神經干細胞(neural stem cells, NSCs)是來源于中樞神經系統的多能干細胞，可以分化為神經元、膠質細胞等多種神經細胞[2]。NSCs可為神經損傷的修復提供源源不斷的原材料，但是其發揮修復損傷的調控機制仍不是十分清楚。Wnt/β-catenin信號通路是神經發育過程中的一條基本通路，可調控NSCs細胞周期的進程，促使NSCs增殖，但是其對NSCs分化方向的影響卻沒有達成共識[3-4]。該實驗通過研究Wnt3a激活Wnt/β-catenin信號通路后對小鼠海馬源性 NSCs的增殖與分化的影響，尋找調控NSCs增殖和分化的關鍵因素，以期為神經系統疾病的預防與治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料隨機選取20只新生24 h昆明種小鼠(體質量2～3 g)，清潔級，合格證號：SCXK(黔)[2018-0001]，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，實驗過程中對動物處理嚴格執行動物倫理學標準。DMEM/F12(1 ∶1)培養基與B27 復合物購自美國 Gibco 公司；堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)、表皮細胞生長因子(epidermal growth factor， EGF)、Wnt3a蛋白購自美國 Peprotech 公司；胎牛血清(FBS)、多聚賴氨酸購自美國 Sigma 公司；磷酸鹽緩沖液(PBS)、0.25% TRYpsin/EDTA、青霉素-鏈霉素溶液購自美國Hyclone 公司；巢蛋白(Nestin)、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)、鼠單克隆5-溴-2-脫氧尿核苷(Brd U)、鼠單克隆神經元特異烯醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)、兔抗鼠單克隆巢蛋白(Nestin)與兔IgG SABC-FITC免疫組化染色試劑盒購自武漢博士德生物公司；4，6-聯脒-2-苯基吲哚溶液(DAPI)、抗熒光淬滅封片劑購自北京Solarbio公司；25 cm2細胞培養瓶、6孔板、15 ml 離心管購自無錫耐思生物科技有限公司。

1.2方法

1.2.1NSCs分離及培養 新生24 h昆明種小鼠斷頭處死，無菌條件下冰上取出雙側大腦，放入盛有4 ℃ PBS 溶液培養皿中漂洗，然后分離海馬組織，仔細剝離腦膜及血管將海馬組織剪碎至2.0 mm 左右，加入0.25% Trypsin/EDTA 2.0 ml，37 ℃消化后用槍頭輕柔吹打至乳糜狀，加入10% FBS終止消化。300目篩網濾過后成細胞懸液，細胞懸液用PBS 溶液清洗一次后加入NSCs完全培養基(DMEM/F12、20 ng/ml bFGF、20 ng/ml EGF、20 ng/ml B27、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素)，以細胞濃度為1×106/ml接種于25 cm2細胞培養瓶。37 ℃、5% CO2條件下培養，每2～3 d半量換液一次，6～7 d傳代。

1.2.2NSCs傳代培養 無菌條件下將細胞懸液轉移至離心管中，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入0.05% Trypsin/EDTA 復合消化酶500 μl，37 ℃消化后用槍頭輕柔吹打20次，加入2.0 ml PBS稀釋消化酶，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，加入NSCs完全培養基重懸細胞，調整細胞濃度為1×106/ml。

1.2.3NSCs誘導分化 預先將6孔板以多聚賴氨酸包被。取培養3 d的NSCs懸液2.0 ml，1 000 r/min離心5 min后棄上清液，分別以NSCs培養基、NSCs分化培養基(DMEM/F12、20 ng/ml B27、10% FBS、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml鏈霉素)2.0 ml重懸，接種至6孔板，每組2個孔加入并標記。37 ℃、5% CO2條件下培養2 d后，行免疫熒光鑒定。

1.2.4NSCs及分化細胞免疫熒光鑒定 取出6孔板，吸出上清液，經清洗、4%多聚甲醛固定、0.1% Triton X-100 通透、3% H2O2滅活內源性過氧化物酶后滴加正常山羊血清封閉液(1 ∶10)，室溫封閉，20 min，甩干，不洗。分別滴加Nestin、NSE、GFAP單克隆抗體(1 ∶100)，對照組不加一抗，用 0. 01 mol/LPBS 代替；濕盒中4 ℃過夜孵育后PBS清洗。分別滴加生物素標記小鼠IgG(1 ∶100)、羊抗鼠IgG(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。滴加SABC-FITC(1 ∶100)，37 ℃孵育30 min，PBS清洗。加入 DAPI 進行細胞核染色，室溫避光孵育 5～10 min，PBS清洗(500 μl/孔×5 min×3次)。加入抗熒光淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.5NSCs的Wnt3a處理及分組 將傳代2～3次所得NSCs分為正常對照組(sham組)與Wnt3a組，Wnt3a組再分為Wnt3a低劑量組(10 μg/ml)、Wnt3a中劑量組(25 μg/ml)和Wnt3a高劑量組(50 μg/ml)。

1.2.6CCK-8檢測 將各組處理后的神經球制成NSCs單細胞懸液，以2×104/孔的密度種植于96孔板內，96孔板的周圍一圈加無菌PBS培養液(因為周圍一圈最容易蒸發，添加水可緩解蒸發)。按實驗順序在每孔中加入100.0 μl相應組別的培養基，培養48 h，同時設立僅加培養基但不含NSCs的孔作為空白對照。培養結束后，每孔內加入濃度10%的10.0 μl CCK-8溶液，37 ℃孵育6 h。用全波長酶標儀在450 nm處檢測吸光度(OD)值。每組細胞設置3個復孔，每個實驗重復3次。結果判定：OD值與培養體系中所含的活細胞數成正比，OD值越大代表培養體系中的細胞數量越多，因此，相同的培養時間內，OD值越大說明細胞增殖的越多，增殖的能力越強。

1.2.7流式細胞儀檢測 將上述分組處理后的NSCs培養48 h；收集細胞后用PBS洗滌細胞一次(離心2 000 r/min、5 min)，收集細胞并調整細胞濃度為1.0×106/ml，取1.0 ml單細胞懸液；制備的單細胞懸液離心后，去除上清液，在細胞中加入體積分數為75%冷乙醇500 μl固定(4 ℃過夜)，染色前用PBS洗去固定液，細胞懸液用200目篩網過濾一次；加入100 μl RNase A 37 ℃水浴30 min；再加入400 μl PI染色混勻，4 ℃避光30 min；上機檢測，記錄激發波長488 nm處紅色熒光；流式細胞術分析。

1.2.8Western blot檢測 將上述分組處理后的NSCs培養48 h后置于6孔培養板中誘導貼壁，經過自然分化6 d后，將所得細胞進行裂解、離心提取蛋白，BCA 蛋白定量后，進行 SDS-PAGE 凝膠電泳和轉膜，用溶于TBST的5%脫脂牛奶進行封閉， 室溫孵育1 h后，加入GFAP、NSE單克隆抗體(1 ∶100)，室溫孵育1 h，置于4 ℃環境中過夜，過夜后室溫下復溫30～60 min，然后用TBST洗滌，隨即加入相應二抗(1 ∶200)，室溫孵育1 h，孵育完成后用TBST洗滌。加入曝光液后，拍照分析。

2 結果

2.1NSCs原代培養結果完整分離出新生24 h小鼠海馬組織，見圖1；原代細胞培養1 d 后可見部分無突起、折光性良好的“滿天星”樣的懸浮細胞，見圖2A；2～3 d 后可見由不同數目細胞組成的、大小不等的細胞球，形態規則，細胞的折光性強，懸浮穩定，呈“桑葚”狀，見圖2B；5～7 d后可見大量神經細胞球，部分神經細胞球可見中心折光性減弱，如“黑帽”樣，見圖 2C，此時位于內部的細胞大量壞死，細胞懸浮穩定性下降，開始出現貼壁分化的現象。

圖1 新生24 h小鼠海馬組織

圖2小鼠海馬組織NSCs原代培養×200

A：原代培養1 d的NSCs；B：原代培養2～ 3 d的NSCs球；C：原代培養5～ 7 d的NSCs球

2.2免疫熒光檢測結果原代培養的小鼠海馬干細胞Nestin染色陽性，并且聚集而成球形，見圖3A。NSCs貼壁后12～24 h出現以NSCs為中心向外周的細胞遷移，呈“齒輪”狀；遷移的細胞突起增多，胞體增大，見圖3B 。神經元誘導培養基培養2 d的NSCs經NSE免疫熒光檢測，可見到胞體呈圓形，周圍有短突起樣的神經元，見圖3C。NSCs經GFAP免疫熒光檢測可見到具有較長突起的星形樣膠質細胞，部分交織成網狀，見圖3D。

2.3CCK-8法檢測結果NSCs不同處理組培養48 h后細胞增殖活力結果見圖4。與sham組比較，Wnt3a低劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統計學意義(t=4.576,F=1.445,P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統計學意義(t=2.628，F=2.089,P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組在450 nm處的OD值增加，差異有統計學意義(t=6.364，F=2.770,P<0.01)。

圖3 NSCs及分化細胞的免疫熒光法鑒定結果 ×200

A：NSCs球，Nestin染色；B：NSCs球出現細胞遷移，Nestin染色；C：神經元，NSE染色；D：星形膠質細胞，GFAP染色

圖4 各組NSCs的CCK-8值

與Sham組比較：*P<0.01；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.05；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.01

2.4流式細胞儀檢測結果NSCs不同處理組培養48 h后細胞周期見圖5A～5D。與sham組比較，Wnt3a低劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統計學意義(t=2.706，F=3.840,P<0.05)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統計學意義(t=2.519，F=1.024，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組細胞所處G1期比例降低，差異有統計學意義(t=2.682，F=2.680，P<0.05)。與sham組比較，Wnt3a低劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統計學意義(t=2.812，F=3.490，P<0.05)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統計學意義(t=2.789，F=1.440，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組細胞所處(S+G2)期比例增加，差異有統計學意義(t=2.459，F=1.432，P<0.05)。見圖5E。

圖5 流式細胞儀檢測Wnt3a對NSCs周期的影響

A： 正常對照組(sham組)；B： Wnt3a低劑量組；C：.Wnt3a中劑量組；D： Wnt3a高劑量組；E： G1期和(S+G2)期的變化；與Sham組比較：*P<0.05；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.05；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.05

2.5Westernblot法檢測結果與sham組比較，Wnt3a低劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統計學意義(t=7.343，F=1.136，P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統計學意義(t=11.59，F=1.417，P<0.001)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組NSE蛋白相對表達量增加，差異有統計學意義(t=5.005，F=1.235，P<0.01)。見圖6B。與sham組比較，Wnt3a低劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義(t=4.070，F=2.136，P<0.01)；與Wnt3a低劑量組相比，Wnt3a中劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義(t=2.488，F=4.259，P<0.05)；與Wnt3a中劑量組相比，Wnt3a高劑量組GFAP蛋白相對表達量降低，差異有統計學意義(t=76.03，F=4.413，P<0.01)。見圖6。

圖6 Western blot檢測Wnt3a對NSCs分化的影響

A：各組NSE、GFAP蛋白表達變化；B：NSE/β-actin相對灰度值比較；C：GFAP/β-actin相對灰度值比較；1：sham組，2：Wnt3a低劑量組，3：Wnt3a中劑量組，4：Wnt3a高劑量組；與sham組比較：*P<0.01；與Wnt3a低劑量組比較：#P<0.001；與Wnt3a中劑量組比較：▼P<0.01

3 討論

NSCs是一類表達特殊標志蛋白Nestin，具有自我更新能力、多向分化潛能、低免疫源性等基本特征的神經祖細胞[5-6]。在哺乳動物中，NSCs主要存在于側腦室的室管膜下區和海馬齒狀回的顆粒下層兩個部位[7]。NSCs可以不斷增殖并遷移至神經系統的不同部位，分化為不同類型的神經元或神經膠質細胞，構成神經系統的各種結構。NSCs的增殖和分化有利于神經系統的生長、發育和修復，這為神經系統的病變提供了有效的治療思路[8]。如何獲得穩定成熟的NSCs，成為研究NSCs需要解決的首要問題。本實驗中觀察到自小鼠海馬分離的細胞在無血清培養基中大部分逐漸死亡、貼壁，少量懸浮生長，經2～3 d可形成穩定的細胞球，經免疫熒光檢測Nestin染色陽性，證明是NSCs。NSCs培養5～7 d后即可傳代，傳代3～4次即可見到純度較高的NSCs。在本實驗中， 對所得NSCs進行一定的誘導，顯示NSCs可分化為表達NSE的神經元和表達GFAP的星形膠質細胞。

Wnt3a由352個氨基酸組成，是Wnt(Wingless-related MMTV integration site)基因家族成員中最早表達的一種蛋白，也是最重要的一種蛋白，在整個中樞神經系統發育的過程中持續表達。Wnt3a主要通過激活經典的Wnt/β-catenin信號通路表達作用。Wnt3a與細胞膜上的受體Frizzled(Fz)和共受體低密度受體相關蛋白-6(Lrp6)結合，促使下游胞質調節蛋白糖原合成酶激酶失活，胞質內β-catenin 數量增多并進入細胞核，后者達到一定水平后進入細胞核，在胞核中β-catenin與轉錄因子家族TCF(T cell factor)/LEF(Lymphoid Enhancer Factor)形成復合體誘導靶基因的轉錄和表達，從而產生靶細胞的增殖、分化等一系列生物學效應[9]。

Wnt/β-catenin信號通路對NSCs的增殖具有明顯作用。體內研究[10]顯示創傷性腦損傷后Wnt3a和β-catenin蛋白在損傷側皮層和海馬區的含量增加，這說明Wnt3a通過經典的Wnt/β-catenin信號通路促進神經細胞的增殖，從而修復損傷的神經組織。體外實驗也表明Wnt3a的表達上調時NSCs的增殖能力顯著提高[11]。本實驗結果顯示，不同處理組培養NSCs 48 h后，與sham組比較，隨著Wnt3a濃度的增加，NSCs相應的在450 nm處OD值增加；所處G1期比例降低，(S+G2)期比例升高；這表明Wnt/β-catenin信號通路激活后NSCs大量進入細胞周期，蛋白質合成增加，物質代謝活躍，處于分裂期的細胞比例提高，增殖能力越強。

Wnt/β-catenin信號通路對NSCs的定向分化具有明顯的調控作用，但是對于具體的分化方向目前還沒有統一的認識。有研究[12-13]表明，在體外胚胎大鼠海馬NSCs培養實驗中，在培養基中添加Wnt3a蛋白，同樣可增加分化神經元的數量，而減少星形膠質細胞分化的數量。還有研究[14]顯示，在體外NSCs培養過程中，加入Wnt3a蛋白可促進NSCs向神經元及星形膠質細胞的分化。但是還有一部分研究[15]表明Wnt3a在調節NSCs增殖的同時，將促進膠質細胞分化的增多，并降低神經元分化的比例，同時通過抑制Wnt3a信號通路的表達將有效增強NSCs向神經元分化的比例。在本研究中，不同處理組培養NSCs 48 h后，用Western blot法檢測不同組別的NSE和GFAP的表達量，與sham組比較，Wnt3a組的NSE蛋白相對表達量明顯提高，GFAP蛋白相對表達量明顯降低。這表明Wnt3a可促進NSCs向神經元的分化，抑制對星形膠質細胞方向的分化，而且這一作用隨著Wnt3a含量的提高而加強。

綜上所述，本實驗成功獲得新生24 h小鼠海馬的NSCs，并可穩定傳代；Wnt/β-catenin信號通路激活后促進NSCs增殖以及向神經元的分化，這為NSCs應用于神經系統疾病的預防與治療提供了理論依據。