LncRNA-HOTTIP促進肺癌發生發展的作用及機制研究

楊 莉，孫耕耘，秦一雨，葛安興

肺癌是人類最常見的惡性腫瘤，我國是肺癌大國，年新發病例數約占全球總數一半，并呈逐年上升趨勢[1]。近年來，手術、放化療等治療手段日益進展，但肺癌整體療效并不理想[2]。研究肺癌發生發展的分子機制對改善目前中晚期肺癌患者預后具有重大意義。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)是一類長度大于200 bp、不編碼蛋白的RNA，通過多種途徑調控基因表達，發揮生物學功能。近年來LncRNA與腫瘤之間的關系逐漸受到重視，它們作為原癌基因發揮促癌作用，也能作為抑癌基因發揮抑癌作用[3-4]。該研究通過長鏈非編碼RNA芯片對肺癌組織和癌旁組織中差異表達的LncRNA進行篩查，發現HOXA遠端轉錄本(HOXA transcript at the distal tip，HOTTIP)基因表達顯著增高，并通過一系列細胞和分子生物學實驗探討HOTTIP對肺癌細胞增殖和凋亡的影響和機制。

1 材料與方法

1.1材料攜帶HOTTIP-shRNA、HOTTIP全長序列的慢病毒以及空白慢病毒購自上海伯豪生物科技有限公司；特異性HOTTIP原位雜交檢測試劑盒(HOTTIP RNAscope 2.0)購自美國Advanced Cell Diagnostic公司；DMEM高糖細胞培養液購自美國Gibco公司；胎牛血清購自美國Hyclone公司；TRIzol裂解液購自美國Sigma公司；PCR引物由上海生物工程技術服務公司合成；反轉錄試劑盒購自日本Takara公司；Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購自美國BD公司；蛋白提取試劑盒購自中國碧云天公司；PVDF膜購自美國Millipore公司；所有抗體包括一抗和二抗均購自美國Santa Cruz公司；ECL化學發光試劑盒購自美國Pierce公司；X-OMAT-Blue film購自美國Kodak公司。

1.2方法

1.2.1組織標本收集 收集銅陵市人民醫院胸外科行肺癌手術的80例肺癌患者，其中男52例，女28例；年齡 37～75歲，中位年齡64歲；肺癌腫塊切除后采用福爾馬林予以固定保存，同時切除腫塊周圍2 cm以外的癌旁組織作為對照組。所有80例患者均簽署了知情同意書和手術同意書。

1.2.2LncRNA芯片檢測 采用TRIzol提取3例肺癌組織及癌旁組織中的總RNA，然后送公司進行LncRNA芯片檢測(美國Agilent公司)。該芯片可檢測41053條LncRNA和29417條mRNA。檢測結果采用Real-time PCR進行驗證。

1.2.3細胞培養 人肺癌細胞株95-D、A549和人永生化肺上皮細胞株BEAS-2B購自中國科學院上海分院細胞庫。三種細胞均采用添加10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養基培養于37 ℃條件下5% CO2的常規細胞培養箱中。在細胞生長至80%融合率時，采用0.25%胰酶消化細胞并進行傳代。

1.2.4慢病毒構建及轉染 攜帶目標LncRNA全長的慢病毒(Lenti-HOTTIP)和攜帶HOTTIP-shRNA的慢病毒(Lenti-HOTTIP-shRNA)由上海伯豪生物科技有限公司完成。在95-D和A549細胞采用無血清培養基培養4 h后，將攜帶目標基因的慢病毒加入到細胞培養基中，繼續孵育12 h。穩定轉染采用加入嘌呤霉素的培養基培養2周。

1.2.5CCK-8法 96孔板中每孔接種2×103個95-D和A549細胞/100 μl過夜，然后加入慢病毒孵育，在孵育12 h后每孔加入10 μl體積的CCK-8溶液，并設計不加慢病毒的細胞作為對照組。加入CCK-8溶液孵育2 h后，放入酶標儀中檢測溶液在450 nm的吸光度。細胞相對生長率=實驗組OD值/對照組OD值×100%。

1.2.6Annexin V/PI實驗 Annexin V/PI實驗按照BD公司提供的試劑盒進行。收集至少1×105個經慢病毒處理后的95-D和A549細胞，用70%預冷的乙醇固定30 min，然后分別加入Annexin V和PI，在黑暗的室溫下孵育15 min，然后上流式細胞儀檢測。

1.2.7Real-time PCR 采用TRIzol提取組織和細胞中的總RNA。首先將RNA反轉錄成cDNA，然后進行PCR擴增，擴增的參數設置如下：95 ℃、8 min預變性；95 ℃、10 s，65 ℃、18 s，72 ℃、16 s，共40個循環。U6作為內參照。引物如下：miR-137：F: 5’-CCGGTGGTCCTCTGACTCTCTTCGGTGACGGGTATT-CTTGGGTGGA-3’;R: 5’-ATTACGTTGTTATTGCTTAAGAATACGCGTAGTCGAGGAGAGTAC-3’；HOTTIP：F:5’-AATTCTGCCGCTGGTACTCTCCTCGACTACGCGTATTCTTAAGCAAT-3’； R: 5’-TAATCCGTATTATCCACCCAAGAATACCCGTCACCGAAGAGA-GTC-3’；U6：F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA;R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.2.8原位雜交實驗 首先將肺癌和癌旁組織制成4 μm后的組織切片，每一張組織切片使用20 ul含有特異性HOTTIP探針的預處理液孵育12 h，然后采用二氨基聯苯胺(DAB)顯色。染色評分采用陽性細胞百分數與染色強度乘積的方法。根據陽性細胞百分數比例分為(0分,<5%; 1分, 5%～25%; 2分, 25%～50%; 3分, >50%)，根據染色強度分為(0分, 陰性; 1分, 弱陽性; 2分, 中等; 3分, 強陽性)。HOTTIP染色評分分級如下：- (0～1分)、+(2～3分)、(4～6分)、(>6分)。據此將HOTTIP表達水平分為兩組：HOTTIP低表達為(-)、(+)；HOTTIP高表達為()、()。

1.2.9Western blot法 總蛋白采用蛋白提取試劑盒完成。取25 μg蛋白樣品經95 ℃水浴加熱變性后，加至SDS-PAGE膠中，然后按序進行電泳、轉膜(0.2 μm PVDF膜)、封閉、一抗孵育、二抗孵育、ECL化學發光、顯影定影。GAPDH蛋白作為內參照。

2 結果

2.1肺癌組織中LncRNA表達譜分析芯片結果顯示(圖1A)，肺癌組織和癌旁組織中共有127個LncRNA表達水平存在顯著差異，表達差異在2倍及以上的LncRNAs一共有22個。在肺癌組織中表達上調的LncRNA有15個，表達下調的LncRNA有7個，其中HOTIIP在肺癌組織中表達上調最為顯著，FC=6.37(表1)。通過Real-time PCR對80例肺癌組織中HOTIIP表達水平進行驗證，結果顯示HOTTIP在肺癌組織中的表達水平顯著高于相應癌旁組織(F=97.267，P<0.001)(圖1B)。

2.2HOTTIP與患者臨床病理因素之間的關系如圖2所示，原位雜交結果顯示HOTTIP主要位于細胞質，在腫瘤細胞胞質中染色強度和陽性率均顯著高于癌旁組織。高表達組52例，低表達組28例。通過χ2檢驗分析，HOTTIP表達水平與性別、年齡、分化程度并無顯著關系，但它與腫瘤大小、TNM分期以及淋巴分期顯著相關。見表2。

2.3HOTTIP對肺癌細胞增殖的影響如圖3所示，HOTTIP在肺癌細胞株95-D和A549中的表達水平顯著高于人永生化肺上皮細胞株BEAS-2B。HOTTIP過表達可以促進95-D和A549細胞增殖，而沉默其表達則可以抑制細胞增殖(P<0.05)。見表3、4。

2.4HOTTIP對肺癌細胞凋亡的影響在經過慢病毒處理72 h后，HOTTIP過表達組細胞凋亡比例與對照組并無顯著差異，而HOTTIP表達下調組細胞凋亡比例顯著增高(P<0.05)。見圖4。

2.5HOTTIP對增殖和凋亡相關蛋白表達的影響如圖5所示，HOTTIP表達下調后(HOTTIP-shRNA)，95-D細胞內p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白表達水平下調， Bax、斷裂的caspase-3蛋白表達水平上調，而HOTTIP過表達后，95-D細胞內p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白表達水平上調，Bax、caspase-3蛋白表達水平不變。Bax、caspase-3、p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白條帶相對灰度值見表5。

表1 表達差異兩倍或兩倍以上的LncRNAs

圖1 肺癌和癌旁組織中HOTTIP表達水平

A：3例肺癌組織及相應癌旁組織芯片篩查熱圖；B：80例癌組織與癌旁組織的表達水平差異；與癌旁組織比較：***P<0.001

圖2 HOTTIP在癌組織和癌旁組織中的原位雜交染色 ×200

2.6HOTTIP與miR-137表達水平相關性分析通過miRDB軟件對HOTTIP與miR-137存在的結合位點進行預測，發現兩者存在結合位點(圖6A)。采用Real-time PCR檢測80例肺癌患者組織中miR-137表達水平，并與HOTTIP表達水平進行相關性分析，結果顯示相關系數為-0.412，P<0.001，提示兩者呈顯著負相關(圖6B)。

表2 HOTTIP表達水平與臨床病理因素的關系(n=80)

3 討論

近年來多項研究顯示長鏈非編碼RNA在腫瘤發生發展過程中發揮重要作用。本研究首先通過芯片篩查發現長鏈非編碼RNA(HOTTIP)在肺癌組織中表達異常增高，并通過Real-time PCR予以驗證。發現HOTTIP不僅在肺癌組織中表達增高，而且其表達水平與某些臨床病理因素如腫瘤大小、淋巴轉移以及TNM分期相關。已有研究[5-6]顯示HOTTIP在一些惡性腫瘤中存在表達增高的現象，如肝細胞癌、胰腺癌等。2017年Zhang et al[7]研究發現HOTTIP在肺癌組織中的表達水平顯著高于正常組織，這與本課題組的研究結果相似。以上研究提示HOTTIP不僅參與肺癌發生發展，還可能成為診斷以及評估分期的標志物。

目前HOTTIP被認為具有原癌基因的特征，可以促進多種腫瘤細胞增殖，其中包括肺癌[8]。在后續的功能學實驗中研究了HOTTIP對肺癌細胞增殖和凋亡的影響，結果提示HOTTIP也參與調控肺癌細胞凋亡。PI3K/AKT/mTOR是調控細胞增殖和凋亡的經典信號通路[9]，研究[10]顯示PI3K信號通路在肺癌中處于異常激活狀態。本課題組發現HOTTIP處理后PI3K信號通路中的成員AKT和mTOR的磷酸化狀態出現增多，說明信號通路被激活，這可能是HOTTIP促進肺癌細胞增殖的重要原因。此外，本課題組還檢測了凋亡相關蛋白Bax和Bcl-2及caspase-3的表達水平。結果顯示HOTTIP-shRNA處理后，Bax表達升高，Bcl-2表達降低，而caspase-3活性片段表達升高，以上結果說明HOTTIP可以通過調控Bax/Bcl-2比例來影響細胞凋亡，但HOTTIP如何調控Bax/Bcl-2蛋白有待進一步研究。

圖3 HOTTIP表達水平對肺癌細胞增殖的影響

A: HOTTIP在95-D、A549以及BEAS-2B細胞中的表達水平；與BEAS-2B比較：*P<0.05；B: HOTTIP表達對95-D細胞增殖的影響；與Control組比較：△P<0.05；C: HOTTIP表達對A549細胞增殖的影響；與Control組比較：#P<0.05

表3 95-D細胞OD值平均值、標準差、P值以及F值

表4 A549細胞OD值平均值、標準差、P值以及F值

圖4 HOTTIP表達水平對肺癌細胞凋亡的影響

A: 流式細胞儀檢測Annexin V/PI雙熒光；B:各處理組中95-D和A549細胞凋亡比例；與Control組比較：*P<0.05

圖5 HOTTIP對增殖和凋亡相關蛋白表達的影響

圖6 結合位點預測及相關性分析

A: HOTTIP序列中存在miR-137結合位點；B: HOTTIP與miR-137表達水平相關性

表5 Bax、caspase-3、p-AKT、p-mTOR和bcl-2蛋白條帶相對灰度值

LncRNA生物學作用方式多種多樣，既可以從轉錄水平也可以從轉錄后水平調控基因表達[11-12]。近年來，學者們發現一種LncRNA調控基因表達的新途徑，就是LncRNA可作為競爭性內源性RNA(ceRNA)與miRNA相互結合，減弱miRNA對其他靶基因表達的抑制作用，并且這種作用方式通常只存在于細胞質中[13]。本課題組研究發現HOTTIP主要存在于細胞質中，提示HOTTIP可能也通過競爭性結合miRNAs發揮生物學作用。于是，本課題組通過軟件miRDB對HOTTIP可能結合的miRNAs進行了預測，結果顯示HOTTIP存在與miR-137結合的序列，本課題組進一步檢測miR-137在肺癌中的水平，發現其表達水平與HOTTIP呈負相關。miR-137被認為是一種抑癌基因，在多種腫瘤中包括肺癌表達下調，可以通過作用于多種靶基因如SRC3和TGFA而發揮抑制肺癌發生發展的作用[14-15]。在今后的研究中，本課題組將通過雙熒光素酶報告基因檢測HOTTIP與miR-137的直接結合，并進一步預測和驗證miR-137的靶基因。