雞豆黃素A對圍絕經期抑郁癥大鼠的神經保護作用及機制研究

楊 琴，梁 楓，李正姐，賀志鵬， 黃超娟，丁楚涵，尹艷艷

圍絕經期抑郁癥(perimenopausal depression disorder, PDD)是女性抑郁癥的常見類型，其典型表現為明顯抑郁，同時伴有焦慮緊張認知障礙等癥狀，給患者自身及家屬帶來極大的心理及生活困擾。目前臨床上多采用雌激素替代療法或雌激素聯合抗抑郁藥治療PDD，該方法雖療效肯定，但激素長期應用的諸多禁忌及潛在致癌性迫切需求療效可靠、副作用小的治療藥物。PDD的發病原因比較復雜，外界環境刺激及體內雌激素水平下降被認為是PDD的主要發病原因[1]。雌激素與相應受體結合后通過基因與非基因效應調控靶基因的轉錄與表達、影響單胺類神經遞質合成、促進神經元生長、抑制神經元凋亡及調控cAMP腦源性神經營養因子(cyclic adenosine monophosphate brain-derived neurotrophic factor，cAMP-BDNF)信號通路等機制發揮保護作用[2-3]。

雞豆黃素A(biochanian A, Bioch A)是一種大豆異黃酮類化合物，研究[4]表明Bioch A與雌二醇結構相似性，可以與雌激素受體結合發揮雌激素效應，對激素引起的相關性疾病具有一定的保護作用。另外大量研究[5-7]發現Bioch A還具有抗炎、抗增殖、抗凋亡、抗腫瘤并且對阿爾茨海默病模型小鼠具有一定的緩解作用。但有關Bioch A對PDD的影響及機制研究未見報道。該研究采用目前公認的大鼠雙側卵巢摘除(ovariectomy，OVX)與慢性不可預知性溫和應激[8](chronic unpre-dictable mild stress，CUMS)兩步法建立大鼠PDD模型，通過行為學、分子生物學等方法及手段，探討Bioch A對PDD模型大鼠的神經保護作用及機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物健康雌性Sprague-Dawley(SD)大鼠150只，SPF級，體質量180～220 g，購自上海杰恩捷實驗動物有限公司。動物在溫度為(25±2) ℃，濕度<60%，光照時間為7:00～19:00 環境中飼養。實驗前禁食12 h，不禁水。

1.2藥物及試劑Bioch A(純度98.2%)購自西安開來生物工程有限公司；氟西汀購自法國patheon公司；去甲腎上腺素(arterenol，NA)、多巴胺(dopamine，DA)及五羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)標準品購自美國Sigma公司；抗白細胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)兔單克隆抗體、抗半胱氨酸天門冬氨酸蛋白水解酶-1(interleukin-1 converting enzyme，Caspase-1)兔多克隆抗體購自英國Abcam公司；鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、cAMP 反應元件結合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)、磷酸化cAMP 反應元件結合蛋白(phosphorylation cAMP response element binding protein，p-CREB)、酪氨酸激酶受體B(tyrosine protein kinase B，TrkB)抗體及兔抗BDNF抗體購自美國Santa Cruz公司；兔抗蛋白激酶A(protein kinase A，PKA)、磷酸化蛋白激酶A(phosphorylation protein kinase A， p-PKA)抗體購自美國CST公司；抗兔或抗鼠二抗購自上海碧云天生物技術有限公司；LunimataTMCrescendo發光液購自美國Millipore公司。

1.3PDD大鼠模型的制備及分組大鼠正常飼養1周適應環境后開始造模，方法如下：用1%的戊巴比妥鈉(0.4 g/kg)腹腔注射麻醉，俯臥于手術臺，固定好腹部，用動物剃毛器將大鼠背部最末肋骨下方毛發剃凈，進行常規消毒后于鼠背最末肋骨下，距脊柱1.5～2.5 cm處切一小口，當看見乳白色的脂肪團時將其拉出體外進行分離，脂肪團中包裹有黃紅色呈細線狀不規則的組織即為卵巢。將卵巢下方輸卵管(包括脂肪)用細線結扎后剔除一側卵巢，同法剔除另一側卵巢。術后將剩余組織放回體內，然后縫合肌肉皮膚并消毒。假手術組僅切除卵巢旁與卵巢同體積大小的脂肪組織。術后精心飼養，1周后將大鼠分為假手術組、模型組、Bioch A(10、20、40 mg/kg)劑量組及氟西汀(2 mg/kg)陽性對照組，每組24只，分三批次完成，每次將各組大鼠分籠飼養。Bioch A和氟西汀用0.5%羧甲基纖維素鈉充分混勻，于每日應激前1 h 灌胃給藥，假手術組和模型組給予等體積(1 ml/100 g)的羧甲基纖維素鈉灌胃，共計21 d。包括冰水游泳(4 ℃、5 min)，熱應激(45 ℃、5 min)，搖晃(1次/s、15 min)，夾尾(將大鼠放入固定籠中，露出尾巴，用止血鉗夾住距尾根部1 cm處，持續1 min)，禁水24 h，禁食24 h，居住環境改變(潮濕墊料)等，各應激因子按隨機方法在21 d內應用，每日給予1種刺激，每種刺激累計使用2～3次，使大鼠無法預料何種刺激發生，以此避免發生適應性。CUMS見表1。

表1 CUMS

1.4行為學指標檢測

1.4.1曠場實驗(open filed test, OFT) 用一個80 cm×80 cm×40 cm的敞箱，地面由等大的25個方格組成，周圍為黑色材料制成，室內為暗光。將大鼠放入反應箱中央，攝像系統記錄動物在曠場內6 min的行為學表現，計算水平運動(3或4只腳同在一個格內計1分，穿越1格計1分，沿線行走每8 cm計1分)及垂直運動得分(大鼠站立次數，雙前足離地1次為1分)。兩只動物之間用75%酒精擦拭底部及四壁，避免對后面大鼠測試產生影響。實驗在應激第22 天完成。

1.4.2強迫游泳實驗(force swimming test, FST) 將大鼠單獨置于水深20 cm的玻璃缸內(高40 cm，直徑20 cm) ，水溫22～25 ℃，游泳6 min，觀察并記錄后4 min內大鼠在水中累計不動時間的總和。每只大鼠實驗結束后洗凈水缸并換水，避免影響后面大鼠測試。實驗在應激第22 天完成。

1.5大鼠海馬組織單胺類遞質含量的測定行為學測試結束后第2天，斷頭處死大鼠，開顱取腦，在冰臺上迅速分離海馬組織，組織稱重后按每4 mg組織加1 ml含高氯酸0.1 mol/L和EDTA 0.1 mmol/L的蛋白沉淀液。用玻璃組織勻漿器將組織勻漿，于4 ℃條件下離心20 min后取上清液，上清液用0.22 μm濾器過濾后上機檢測。單胺類遞質經分析柱分離后再經電化學檢測器進行定量檢測，在色譜軟件工作站顯示并分析結果。通過標準品的保留時間和峰面積確定遞質種類并計算遞質濃度。

1.6Westernblot檢測大鼠IL-1β及Caspase-1、p-PKA、PKA、p-CREB、CREB、BDNF、TrkB表達低溫提取海馬總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每孔上樣50 μg蛋白，12% SDS-PAGE分離樣品，轉膜，封閉，分別滴加GAPDH(1 ∶2 000)、IL-1β(2 μg/ml)、Caspase-1(1 μg/ml)、p-PKA(1 ∶1 000)、PKA(1 ∶1 000)、p-CREB(1 ∶500)、CREB(1 ∶1 000)、BDNF(1 ∶1 000)及TrkB(1 ∶1 000)一抗4 ℃過夜。洗膜，滴加相應二抗(1 ∶2 000)室溫孵育1 h。洗膜后將高靈敏的LunimataTMCrescendo發光劑加到膜的正面，采用Bio-Rad ChemiDoc XRS+成像系統進行拍照，用Image J 1.43(National Institutes of Health)軟件進行灰度值測量。將目的蛋白與內參蛋白(GAPDH)或非磷酸化蛋白灰度值比值作為目的蛋白的相對表達量。

表2 Bioch A對PDD 大鼠行為學的影響

與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖1 Bioch A對PDD 大鼠海馬IL-1β及Caspase-1表達的影響

2 結果

2.1BiochA對PDD大鼠行為學的影響與假手術組相比，模型組大鼠水平和豎直得分均明顯減少，強迫游泳不動時間顯著增加(P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組水平和豎直得分均明顯增加，而強迫游泳不動時間減少(F= 174.7、87.57、26.4，P<0.05，P<0.01)。見表2。

2.2BiochA對PDD大鼠海馬單胺類神經遞質變化的影響與假手術組相比，模型組大鼠海馬組織DA、NA及5-HT的水平均明顯降低(F=34.63、58.16、42.07，P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬5-HT的水平均不同程度升高(P<0.05，P<0.01)。見表3。

2.3BiochA對PDD大鼠海馬IL-1β及Caspase-1表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠海馬IL-1β、Caspase-1表達水平均明顯升高(P<0.05,P<0.01)。與模型組相比，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬IL-1β、Caspase-1表達水平均不同程度降低(F=43.09、58.24，P<0.05,P<0.01)。見圖1。

表3 Bioch A對PDD 大鼠海馬單胺類神經遞質變化的影響

與假手術組比較：**P<0.01；與模型組比較：#P<0.05,##P<0.01

圖2 Bioch A對抑郁癥大鼠海馬PKA及CREB磷酸化水平的影響

2.4BiochA對PDD大鼠海馬PKA及CREB磷酸化水平的影響與假手術組相比，模型組大鼠海馬PKA及CREB蛋白磷酸化水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬PKA及CREB蛋白磷酸化水平均不同程度升高(F=177.6、164.0，P<0.05，P<0.01)。見圖2。

2.5BiochA對PDD大鼠海馬BDNF及TrkB表達的影響與假手術組比較，模型組大鼠海馬BDNF、TrkB 表達水平均明顯降低(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組海馬BDNF、TrkB 表達水平均不同程度升高(F=140.6、62.59，P<0.05，P<0.01)。見圖3。

3 討論

本研究顯示與假手術組相比,模型組大鼠在曠場實驗中水平與垂直運動次數明顯減少，說明模型組大鼠活動度降低，對周圍新鮮環境的好奇性降低；模型組大鼠海馬組織DA、NA及5-HT的含量與假手術組相比均明顯降低，可見PDD 大鼠出現了單胺類神經遞質的紊亂，而與模型組比較，Bioch A 20、40 mg/kg劑量組及氟西汀組大鼠在礦場實驗中水平與垂直運動次數明顯增加，5-HT的水平均不同程度升高，提示Bioch A與氟西汀一樣能夠改善抑郁模型大鼠的行為，起到一定的抗抑郁作用。

抑郁癥的發病機制非常復雜，目前認為5-HT等單胺類神經遞質的功能降低在抑郁癥的發生、發展中起關鍵作用[9-10]。而細胞因子可影響抑郁癥患者大腦中單胺類神經遞質的作用[11]，本研究顯示與假手術組相比模型組大鼠海馬中細胞因子IL-1β及Caspase-1表達水平均明顯升高，說明炎癥因子參與抑郁活動。研究[12-13]已證實神經元再生比較集中的海馬顆粒細胞下層及其附近有磷酸化PKA及CREB的高表達，CREB不僅能增強海馬神經元的整合和功能的可塑性，而且可直接調控BDNF的合成及轉錄。BDNF通過與其高親和力受體TrkB結合后對神經元的生長、分化、存活及損傷后修復有重要的作用，并與長時程增強、學習、記憶有關[14]。實驗證實，氟西汀等抗抑郁藥均可激活腺苷酸環化酶，提高cAMP含量，上調cAMP-CREB功能，增加海馬BDNF、TrkB的表達[15]。上述研究表明，抗抑郁藥可以通過激活PKA，增強CREB的表達水平或磷酸化水平，進而介導BDNF的功能，促進海馬神經元再生，可見cAMP-CREB-BDNF信號通路是抑郁癥神經元再生關健性環節之一。本研究同時發現與假手術組相比，模型組海馬組織PKA及CREB磷酸化明顯降低，同時BDNF及TrkB 表達水平不同程度降低；與模型組相比，不同劑量Bioch A和氟西汀均能上調海馬區PKA及CREB磷酸化水平，提高BDNF及TrkB表達水平。

圖3 Bioch A對PDD 大鼠海馬BDNF及TrkB表達的影響

綜上所述，Bioch A可能降低海馬IL-1β的含量，上調色氨酸羥化酶表達，促進5-HT的合成與釋放，進而通過G蛋白偶聯信號通路調節cAMP的活性，激活PKA進而磷酸化CREB，最終促進BDNF及TrkB的表達，促進海馬神經元的再生而具有一定的抗抑郁作用。