Cel48F產物排出過程中酶-底物相互作用及關鍵殘基的分子動力學模擬

劉天志, 董 瑩, 鄂鏡雯, 韓 菲, 李 卓*, 張 浩

(1. 盛實百草藥業有限公司, 天津 300000;2. 吉林大學 a. 理論化學研究所, 吉林 長春 130061, b. 白求恩制藥廠, 吉林 長春 130012)

作為高等植物細胞壁的主要成分,纖維素廣泛存在于植物和藻類等生物質中,是地球上分布最廣、最豐富的可再生資源[1].纖維素可以被纖維素酶高效水解,先降解為短鏈糊精或纖維二糖,最終被降解為葡萄糖[2-3].這些單糖可以通過微生物發酵技術生產出生物乙醇,緩解因使用化石燃料帶來的環境污染[4-7].

纖維素酶Cel48F是一種典型的具有連續內切活性的纖維二糖水解酶[8-9].晶體結構研究表明,Cel48F結構中有2個重要的區域[9,11]:底部是一個由6個α-螺旋圍成的特定供水通道[12];上部是1個底物結合區域,該結合區域由1個底物結合通道和1個產物裂縫組成,特定供水通道、底物結合通道和產物裂縫三者形成1個Y字形結構[9].底物結合通道里有7個特定的糖單元結合子位置[13],分別為-7～-1,裂縫與通道相連,有4個特定的糖單元結合子位置+1～+4,水解發生在-1和+1子位置之間,在裂縫的4個子位置中,+1和+2是產物的初始結合位置,而+3和+4是虛位置,在野生型酶的實際水解過程中,底物鏈在水解前不可能達到這兩個位置(因為水解產物是纖維二糖,因此水解前只可能占據+1和+2子位置),只是在產物排出過程中可能起到結合產物的作用[9,13].

在之前的研究中,筆者深入探究了纖維素酶過程性水解中的選擇機制[14].另外,還對一個能顯著影響酶活性但其具體作用尚不清楚的Glu 44在水解中的作用進行了詳細研究,確定了Glu 44的一些可能作用,在研究Glu 44的作用過程中,使用了拉伸分子動力學模擬(SMD)的方法,發現Glu 44在產物纖維二糖從酶中排出過程中參與了氫鍵網絡的重組,進而輔助底物排出[15].在進行該工作時,發現對該酶的產物解離過程目前尚沒有完整的研究,之前進行的拉伸動力學研究雖然能考察產物的動態解離過程,但由于其需要固定的拉伸方向,以及拉伸過程中纖維二糖不可旋轉等特點,導致其并不能完全真實地體現產物解離過程.想研究產物解離過程,最直接的辦法是將底物在水解位置斷開后,進行一個長的無任何限制的分子動力學模擬,直到最終產物從酶中脫離.但是,模擬該過程所需時間較長,在現有的計算條件下很難實現.好在晶體結構提供了產物解離過程中可能經過的特定結合位置(即+1～+4子位置),因此,可以手動將產物分別放在不同的結合位置上,再分別進行分子動力學模擬,研究產物在不同位置時的結合模式,最終就能匯總出大致的產物解離過程.

1 實驗部分

1.1 初始構象獲得

共模擬了4個酶-五糖復合物體系,4個體系的蛋白完全相同,其初始結構均來自蛋白質數據庫(Protein Data Bank, PDB,編號1FAE).在4個體系的初始復合物中,底物和產物分別被連接在不同的位置,其中初始復合物A中底物為纖維五糖,結合于-3～+2子位置,即水解未發生前的酶-底物復合物;初始復合物B中糖單元也結合于相同的-3～+2子位置,但在-1和+1間糖苷鍵被手動斷開,其中占據-3～-1子位置的是殘余底物,占據+1～+2位置的為產物纖維二糖,這是水解發生后產物尚未移動時的復合物;初始復合物C和D中殘余底物位置不變,產物分別結合于+2～+3和+3～+4子位置,為產物向出口連續移動1個和2個子位置時的復合物(見圖1).

圖1 本文模擬的4種初始復合物中底物和產物的位置Fig.1 The positions of substrate and product in all four initial complexes simulated in the present work

1.2 計算方法

(1) 分子動力學模擬.選用GROMACS 4.5.2分子動力學軟件來研究生物分子體系[16],對Cel48F的蛋白分子和糖鏈底物分別施加CHARMM27力場和CHARMM22力場來生成各自的拓撲文件和力場參數文件[17].將體系置于正方體的水盒子中心,溶劑選取TIP3P水分子模型[18]并保持截斷半徑為1.0 nm.首先,用最陡下降法對復合物進行初步的結構優化來消除分子間不合理的構象碰撞.經過能量最小化之后,體系初步達到一個局部的能量低點.然后經過500 ns的NVT和500 ns的NPT過程,使體系最終達到恒定的溫度(310 K)和1個標準大氣壓,其中長程靜電力采取Particle Mesh Ewald(PME)的方法處理[19].壓力和溫度分別采用V-rescale和Parrinello-Rahman的方法進行擬合,而所有的成鍵原子間的距離通過LINCS算法來固定[20].最后,分子動力學模擬過程施加到整個體系中,積分步長為2 fs,軌跡每10 fs保存一次用于后續的數據分析.

(2) 結合自由能計算.蛋白質分子和配體之間的分解自由能通過Amber 10軟件包的MM/PBSA程序來計算[21-22].在Amber ff99SB的立場下,100幀的構象從動力學軌跡中被提取出用來計算平均結合自由能.每個殘基對配體的能量貢獻會從三個方面被統計,包括靜電作用(Gele),范德華作用(Gvdw),以及溶劑化作用(Gsolv),這三者中,靜電作用經常與氫鍵相關,范德華作用經常與疏水相互作用相關.依據公式如下:總的殘基-配體結合自由能等于這三項之和,表示為ΔGtotal=ΔEvdw+ΔEele+ΔGsolv[23].其中,溶劑化作用又分為極性溶劑化作用和非極性溶劑化作用.溶劑化自由能的計算采用Adaptive Poisson-Boltzmann Solver(APBS) 程序來計算.自由能的每一項貢獻都取自于相同的構象計算.根據不同殘基和配體的結合自由能強弱,可以了解在活性中心處對配體穩定有突出貢獻的殘基[24].

2 結果與討論

2.1 總體構象對比

在分別以4個復合物A、B、C、D為初始構象進行了4個50 ns的分子動力學模擬后(所有4個模擬結果的三維結構可在支持信息中名為A.pdb,B.pdb,C.pdb,D.pdb的4個文件中找到),首先分析了4個模擬過程中均方根偏差(RMSD)的變化,除了復合物C是在約20 ns后達到平衡外,其余3個RMSD值都是在初始很短階段的上升后(<1 ns)即達到平衡,平衡后的RMSD值在很小范圍內波動(<0.05 nm).然后,將50 ns模擬后的4個構象,分別去掉底物,使用DS 2.5程序進行相似性對比,對比結果表明,以復合物A模擬后的構象為參考,復合物B、C、D的構象與A構象的相似性分別為0.819 844,0.824 882和0.819 156(相似性在0～1之間,越接近1說明其相似度越大),4個復合物蛋白部分相似性很高,說明產物的逐步排出并未引起蛋白構象的顯著變化.

值得注意的是,在A、B、C構象中,無論底物是否在水解位置斷開,在50 ns模擬之后,底物和產物的位置雖然均有變化,但都沒有從蛋白中解離,而在D構象中,產物很快就從酶中解離(<10 ns).產物在不同構象中的這種差異是由于在Cel48F中,產物解離的主要動力是來自外界溶劑的作用,即當產物由親脂的長鏈纖維素解離為親水的纖維二糖之后,溶劑水分子容易將其包裹并帶出酶中,實現產物解離[25].但是,由于Cel48F產物位置是逐漸變寬的裂縫,使得在初始解離和移動后(即產物在B、C兩構象時),裂縫比較狹窄,并且裂縫側壁上有很多疏水殘基,使得外界水分子不容易進入到產物周圍,因此產物也就不容易在短時間內被帶出,而當產物到達D構象位置時,由于裂縫變寬,水分子容易進入并包裹產物,因此可在極短的時間內被帶出酶中.

如上所述,由于D構象可以被認為是產物排出過程的終點,此位置產物與酶的相互作用很少,非常容易解離,與筆者研究的主題,即產物排出過程中產物與周圍殘基的相互作用關聯較小,因此,后文中將不再討論該構象.

2.2 關鍵殘基的構象及相互作用變化顯示其在產物排出中的作用

2.2.1 底物非還原末端周圍殘基及相互作用

底物的-3端為非還原末端,而+2端為還原末端,首先討論非還原端,即-3～-1糖單元(在B、C復合物中是殘余底物)周圍殘基與底物間的相互作用.

(1) 氫鍵相互作用.對A、B、C三個模擬,在其構象平衡階段隨機選取10個快照截圖,使用GROMACS程序對底物和蛋白間氫鍵進行自動搜索,程序默認氫鍵范圍為X…H…Y,鍵角大于120°,并且2個重原子X與Y之間距離小于等于0.35 nm.所有3個模擬的全部30個截圖中存在的氫鍵列于表1中,其中一些較重要的氫鍵在A構象中與底物關系如圖2所示.對于表1中的氫鍵,在3種構象中各自截取5 000個快照截圖,并分別統計表1中的氫鍵在所有5 000個快照截圖中存在的比例,也列于表1中.

表1 底物周圍的氫鍵以及該氫鍵在所有3個模擬過程中提取的5 000幀快照中的存在率

從表1中可以看出,在-3～-1子位置一端,由于其位置在不同構象中未發生變化,因此酶中殘基與其形成的氫鍵的變化也相對較小,在A、B構象中,存在幾率最高的氫鍵幾乎完全一致,包括Ser 54～-1糖單元,Glu 55～-1、+1糖單元的多氫鍵,Trp 298～-2糖單元,Trp 154～-3糖單元,Phe 180～-3糖單元.結合自由能的結果可以進一步驗證這些氫鍵,表2～表4中列出了3種構象中擁有較明顯靜電、范德華或總結合自由能貢獻的殘基(絕對值大于4.182 kJ·mol-1).從A構象的結合自由能計算(表2)中可以看出,Trp 154和Phe 180中,并沒有較明顯的靜電貢獻,反而是范德華作用非常明顯,這說明以上2個殘基與底物間的靠近主要是由于形成疏水相互作用而不是氫鍵,高的氫鍵存在率只是因為在統計時相關原子恰好處于氫鍵范圍內.不管是氫鍵還是疏水相互作用,在A、B構象中是相當穩定的,它們可以將底物束縛在特定的底物結合位置上.在這2種構象中,只有Asp 230～-1糖單元間的氫鍵存在率發生了較大變化(從99.84%降到9.68%),這可能與Asp 230的功能與其他殘基不同有關,在之前的研究中,Asp 230被認為是關鍵結合親核水分子的堿殘基,因此,在水解前(A構象),它應與底物有較強的相互作用,以保證水分子能夠進攻正確的位置,而在水解后(B構象),它應該遠離底物,使逆反應不易發生.與A、B構象中糖單元位置基本沒有變化不同,在C構象中,由于產物移動到了+2～+3子位置上,使其離殘余的-3～-1糖鏈較遠,兩者間相互作用減小,因此導致了-3～-1糖鏈也有一個很小的位置變化并使其與底物間氫鍵有一定變化.但是,存在率最高的幾個氫鍵,如Phe 180～-3糖單元、Trp 298～-2糖單元間的氫鍵仍能保持.氫鍵的變化主要體現在Glu 54～-1糖單元、Glu 55～-1糖單元、Trp 154～-3糖單元間氫鍵存在率的降低及新的Asn 227～-2糖單元和Tyr 323～-1糖單元間的氫鍵存在率的升高.

表2 A構象中有顯著的結合自由能(絕對值大于4.182 kJ·mol-1) 的殘基及其分解的結合自由能數值

表3 B構象中有顯著的結合自由能(絕對值大于4.182 kJ·mol-1)的殘基及其分解的結合自由能數值

表4 C構象中有顯著的結合自由能(絕對值大于4.182 kJ·mol-1)的殘基及其分解的結合自由能數值

圖2 構象A中未水解的底物和酶中殘基間的相互作用Fig.2 The interactions between unhydrolyzing substrate and residues in A conformation

(2) 疏水相互作用.除了氫鍵作用外,疏水相互作用在蛋白與底物結合過程中也起到重要作用.從表2中的結合自由能可以看出,在構象A中,在-3～-1一側, Glu 55、Trp 154、Phe 180和Trp 298擁有最明顯的范德華貢獻(∣ΔEvdw∣>8 kJ·mol-1),并且這些范德華貢獻在B和C構象中變化也不大(見表3,表4).

綜上所述,-3～-1端底物構象及于蛋白相互作用的變化均不大,并且與筆者主要關心的產物排出無關,因此對這一側不做重點討論.

2.2.2 底物還原末端周圍殘基及相互作用

圖3顯示了將A、B和B、C構象分別進行對比的結果,結合氫鍵存在率及結合自由能的計算,就可以得到從水解開始到產物排出過程中產物和關鍵殘基的變化.首先對比A和B構象(如圖3a所示),在+1～+2子位置間,A與B構象中存在的氫鍵的最明顯差別在于,A構象中,Glu 55主要與+1糖形成氫鍵,Glu 44與+2糖單元間氫鍵存在率較低(67.93%),另外,Trp 611與+1糖單元間也有一定的氫鍵存在率(53.71%).盡管Glu 44、Trp 611在此構象中與底物間形成的氫鍵并不穩定,存在率只略高于50%,但是A構象中的結合自由能顯示,此時這2個殘基與底物之間,都已經有比較明顯的靜電相互作用(靜電貢獻分別為-11.62 kJ·mol-1和-6.02 kJ·mol-1).而B構象中,由于-1與+1間糖苷鍵斷開,產物纖維二糖不再受到-3～-1底物的限制,因此它在Glu 44和Trp 611的作用下,向Glu 44方向滑動了一小段距離,使得原本只是有相互作用但還未形成穩定氫鍵的Glu 44～+2糖單元,Trp 611～+1糖單元間均形成了穩定的氫鍵(氫鍵存在率上升到94.5%和74.91%),同時,表3中這2個殘基的靜電貢獻也大幅增強(分別達到-27.54 kJ·mol-1和-10.91 kJ·mol-1).該滑動還使Glu 55與+1糖單元間距離變遠,并進一步導致兩者間的氫鍵斷開,Glu 55轉而與-1糖單元形成氫鍵(盡管表1中A、B兩種構象里Glu 55與底物的氫鍵存在率相差不大,但自動分析不能區分其到底與哪個糖單元形成氫鍵,更詳細的構象分析表明在A中,Glu 55主要與+1糖形成氫鍵,而在B中,其主要與-1糖形成氫鍵).這個小的移動可能是Glu 44(或者也包括Trp 611)在酶催化水解過程中最關鍵的作用,它使產物離開殘余底物和關鍵催化殘基(Glu 55被認為是催化中對活性影響最大的提供質子的酸殘基[3,26])一段距離,避免了逆反應的發生,相當于加快了水解反應的速度,這可以解釋實驗中將Glu 44突變為Gln 44后,酶活性顯著降低卻沒有完全消失的現象.

圖3 分別對比(a)A/B構象間和(b)B/C構象間與產物發生相互作用的殘基

繼續對比B和C構象(圖3b)可以看出,當產物從B構象所處的位置繼續向外滑動過程中,其內側的糖單元(初始構象中位于+2子位置)明顯向產物裂縫上方移動,并與該方向上的Thr 410形成氫鍵,而外側糖單元(初始構象中位于+3子位置)則只是受內側糖單元影響輕微地向上方發生位移.在B構象中,Thr 410與產物間的氫鍵存在率為0,而在C構象中,雖然該氫鍵的存在率僅為12.88%,但值得注意的是,由于模擬過程中,產物是逐漸向Thr 410方向移動的,因此,實際上在模擬40 ns以后,產物與Thr 410才進入氫鍵范圍.而40～50 ns區間內的氫鍵統計顯示,Thr 410與底物形成氫鍵的比例已高達50.2%.另外,結合自由能的計算也顯示在C構象中,Thr 410與底物間的靜電相互作用也有顯著增強(從-0.38 kJ·mol-1變為-7.03 kJ·mol-1).

結合自由能計算能明顯地顯示出內側糖單元向上移動的驅動力,從表2～表4中的結合自由能結果中可以看出,盡管A和B構象中,底物與裂縫上方殘基都沒有明顯的靜電作用,但其中一個擁有大的芳香環的Trp 411,在A、B、C三個構象中均顯示出了非常顯著的范德華貢獻,可以認為,該殘基是從B向C構象變化中使產物向裂縫上方移動的初始驅動力,而在產物移動到接近C構象的位置后,該方向上另外幾個殘基,包括Pro 406、Thr 410、Thr 462、Glu 542和Arg 544,與產物形成了較明顯的相互作用,使產物進一步向它們靠近.在產物裂縫的上方,即Thr 410和Trp 411附近,裂縫開口較大,溶劑水分子更容易進入并最終帶走產物.

對外側糖單元而言,Asp 494與其形成的氫鍵存在率迅速上升(從B構象中39.03%到C構象中的62.28%),特別是在40 ns以后,其存在率超過了80%,表4中的結合自由能結果也顯示Asp 494與底物間有很明顯的靜電相互作用(10.91 kJ·mol-1).正是由于Asp 494的存在,使得外側糖單元并沒有向上方移動太多.這種作用使產物大致體現出一種以外側糖單元為中心的轉動,導致其不再緊貼產物裂縫的一側,并在內側糖單元原本的位置上留下一個空腔,使外部的溶劑水分子容易進入并包裹產物.

新相互作用形成的同時,B構象中原有的Glu 44與Trp 611與底物形成的氫鍵存在率在C構象中都大幅下降,但是,結合自由能計算表明,盡管這2個殘基與底物距離超出了正常氫鍵,但它們與底物間的靜電貢獻,雖然也有所減小,但仍十分明顯,這種相互作用,可能使產物在C構象所處的位置附近上下震動,幫助溶劑水分子更容易進入產物內側.

3 結 論

從以上模擬結果的討論可知,由于-3～-1位置的糖單元沒有明顯變化,因此其在產物排出過程中與周圍殘基所形成的相互作用變化不大,特別是主要維持底物位置的Glu 55～-1或+1糖單元,Phe 180～-3糖單元,Trp 298～-2糖單元間的氫鍵,以及Glu 55、Trp 154、Phe 180和Trp 298等與底物間的疏水相互作用.而在+1～+2端,相互作用變化較大,產物先是在Glu 44和Trp 611作用下向出口移動一個小的距離,使產物遠離殘余底物,防止逆反應發生,接著,產物繼續向外移動,在此過程中其內側糖單元在Trp 411作用下向產物裂縫上方移動,并與Thr 410形成弱氫鍵.而外側糖單元則與Asp 494形成氫鍵,并在該殘基束縛下,只輕微向裂縫上方移動.內外側糖單元不同運動模式,使產物整體發生轉動,并在內側糖單元原本的位置上留下一個空腔,使外部的溶劑水分子容易進入并包裹產物.