斑禿患者外周血Th9細胞及相關細胞因子的表達及意義

趙穎 盛友漁 胡瑞銘 趙俊 芮文龍 齊思思 楊勤萍

復旦大學附屬華山醫院皮膚科 復旦大學皮膚病研究所，上海 200040

通常認為斑禿是一種T細胞介導的累及毛囊的器官特異性自身免疫性疾病，其發病機制涉及遺傳學、自身免疫學、精神因素和微量元素缺乏等［1-2］，但其確切病因及分子機制尚不明確。Th9細胞是近年來新發現的CD4+T細胞，以分泌白細胞介素9（IL-9）為特點，參與多種疾病（腫瘤、自身免疫性疾病以及病原體介導的免疫相關疾?。┑陌l病，發揮免疫應答及免疫調節作用［3］。斑禿皮損病理顯示有大量淋巴細胞浸潤，以CD4+T細胞為主［4］。既往也有T細胞失衡參與斑禿發病的報道［5］。本研究通過檢測斑禿患者外周血中Th9細胞比例、IL-9及相關轉錄因子、細胞因子的水平，探討其在斑禿發病中的臨床意義。

對象與方法

一、研究對象與分組

選取2017年5-12月就診于復旦大學附屬華山醫院皮膚科門診的74例斑禿患者作為斑禿組，男30例，女44例，年齡14～69（39.30±1.59）歲。其中重癥40例，輕癥34例；活動期56例，穩定期18例；病程＜6個月51例，＞6個月23例。57例本院健康體檢者作為對照組，排除重大系統性疾病及感染性、腫瘤性、自身免疫性及過敏性疾病，男22例，女35例，年齡18～64（38.63±1.67）歲。兩組性別、年齡構成差異無統計學意義。

斑禿組納入標準：①性別不限；②年齡16～70歲；③根據臨床表現符合斑禿診斷，即皮損表現為圓形或橢圓形、邊界清楚的非瘢痕性脫發斑片。排除標準：①由其他疾病引起的脫發，如拔毛癖、瘢痕性脫發、頭癬、休止期脫發、梅毒性脫發等；②合并其他嚴重的系統性疾病，如嚴重高血壓、糖尿病、心臟病、腎功能不全、精神疾病史等；③合并感染性、腫瘤性、自身免疫性及過敏性疾病，如銀屑病、自身免疫性甲狀腺炎、類風濕關節炎、特應性皮炎及哮喘等；④1個月內曾系統性使用免疫抑制劑、糖皮質激素、羥氯喹等；⑤妊娠及哺乳期婦女。

74例斑禿患者根據病情嚴重程度又分為2組：脫發面積≤49%者為輕癥組，＞49%者為重癥組。根據Olsen的脫發嚴重度（SALT）評分［6］分為S1～S5級，其中S1級21人，S2級13人，S3級20人，S4級13人，S5級7人。根據患者病程，分為＜6個月組，＞6個月組。根據疾病活動性分為活動期和穩定期：在脫發斑片邊緣施力牽拉約50～60根頭發，重復數次，若脫發根數超過10%判定為牽拉試驗陽性，表示病情呈活動性；反之陰性，代表病情穩定［7］。本研究方案符合世界醫學協會2000年版赫爾辛基宣言，并獲得華山醫院倫理委員會批準，批件號：（2011）臨審第（278）號。所有研究對象均充分了解試驗內容，并簽署知情同意書。

二、方法及試劑

1.主要試劑與儀器：流式細胞儀（美國BD公司），酶標儀（美國Thermo公司），Ficoll-Paque PLUS淋巴細胞分離液（美國GE公司），ELISA試劑盒（上海威奧生物科技有限公司），IL-9-PE、人CD4-FITC抗體、IL-17A-PerCP-Cy5.5（美國BD公司）。

2.ELISA檢測外周血細胞因子水平：取受試者外周血3 ml，離心取上清液用于IL-9、IL-4、轉化生長因子β1（TGF-β1）、γ干擾素（IFN-γ）檢測。參照ELISA試劑盒說明操作，用酶標儀在450 nm處測量吸光度（A值），根據樣品A值計算相應細胞因子含量。

3.Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個核細胞（PBMC）：取肝素鈉抗凝外周血4 ml，用磷酸鹽緩沖液（PBS）等倍稀釋，混勻。取4 ml淋巴細胞分離液置于15 ml離心管中，管壁傾斜45度，將稀釋全血緩慢滴入淋巴細胞分離液的液面上，800×g離心20 min。吸取中間懸浮的白色云霧狀細胞層為PBMC，PBS洗滌PBMC，400×g離心7 min，棄上清液。PBS再洗滌1次，300×g離心10 min，收集細胞，-80℃保存。

4.流式細胞儀檢測CD4+IL-9+細胞比例：復蘇、收集PBMC（1×106～5×106個細胞），用RPMI 1640重懸至1 ml，加入6孔培養板，再分別加入含20%胎牛血清的RPMI 1640 1 ml，每孔加入細胞刺激劑4μl，置37℃、5%CO2培養箱中培養4.5 h。吸出細胞懸液到離心管中，350×g離心5 min，去上清液，加1 ml PBS重懸；再次350×g離心5 min，去上清液，加1 ml PBS重懸后備用；取100μl細胞加入EP管中，同時加入表面抗體FITC-CD4，4℃避光孵育15 min；1 ml PBS重懸，350×g離心5 min，去上清液，加1 ml固定液，避光放置50 min；加入1 ml破膜液，350×g離心5 min，去上清液；再次加入1 ml破膜液，350×g離心5 min，去上清液；胞內抗體染色（IL-9抗體和IL-17A抗體）15 min；1 ml破膜液重懸，350×g離心5 min，去上清液，300μl破膜液重懸，上機檢測，細胞收集10 000個，中速收集，定義CD4+IL-9+IL-17-細胞為Th9細胞。

5.實時熒光定量PCR法檢測IL-9及相關轉錄因子mRNA的表達：收集PBMC，每5×106細胞加入1 ml Trizol充分吹打混勻，加入200μl氯仿提取總RNA，逆轉錄cDNA。參照Gene Bank數據庫中目的基因PU.1及IL-9序列，用NCBI Primer-blast設計引物，由蘇州金唯智生物科技有限公司合成。PU.1上游引物序列：5′-CCAGCTCAGATGAGGAGG AG-3′，下游引物序列：5′-CAGGTCCAACAGGAACTGGT-3′；IL-9上游引物：5′-CCTCTGAC AACTGCACCAGA-3′，下游引物序列：5′-CATGGCTGTTCAC AGGAAAA-3′；內參基因β肌動蛋白上游引物序列：5′-GCAGAAGGAGATCA CTGCCCT-3′，下游引物序列：5′-GCTGATCCACAT CTGCTGGAA-3′。PCR反應體系（10μl）：H2O 1.5μl，2×SYBGEEN PCR mix 5μl，上下游引物（10 nmol/L）各0.5μl，cDNA 2.5μl。反應條件：95℃2 min，95℃5 s，60℃10 s，共45個循環，繪制熔解曲線。反應結束后，根據RT-PCR的擴增曲線和熔解曲線，記錄CT值進行PCR定量分析，采用2-△△Ct法分析目標基因的相對表達量。

三、統計分析

Excel 2017錄入數據，SPSS17.0統計軟件分析數據，Graphpad prism 6軟件繪制統計圖，結果用±s表示。兩組獨立樣本的比較，正態分布資料使用t檢驗，相關分析采用Spearman相關檢驗，P＜0.05認為差異有統計學意義。

結 果

一、斑禿患者與健康對照血清中細胞因子水平

斑禿組血清IL-9水平顯著低于對照組（P＜0.01），而TGF-β1及IFN-γ水平顯著高于對照組（均P＜0.05）。兩組IL-4水平差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 斑禿患者血清中Th9細胞相關細胞因子水平（±s，ng/L）

表1 斑禿患者血清中Th9細胞相關細胞因子水平（±s，ng/L）

組別斑禿組對照組t值P值例數74 57白細胞介素9 190.40±12.33 288.10±17.38 4.71＜0.01白細胞介素4 19.65±4.80 21.29±3.22 0.27＞0.05轉化生長因子β1 6 191.00±355.50 4 026.00±258.00 4.41＜0.01 γ干擾素15.71±3.00 8.79±0.60 2.00＜0.05

斑禿活動期組與穩定期組、病程＜6個月組與＞6個月組IL-4、TGF-β1及IFN-γ水平差異均無統計學意義（P＞0.05）。重癥與輕癥組IL-9、IL-4及TGF-β1水平差異無統計學意義（P＞0.05），但重癥組IFN-γ水平低于輕癥組，差異有統計學意義（P=0.02），見表2。Spearman相關分析顯示，斑禿患者IFN-γ水平與SALT分級呈負相關（rs=-0.298，P=0.010），與疾病活動（rs=-0.068，P=0.566）及病程（rs=0.168，P=0.152）無顯著相關性。

二、斑禿患者PBMC中Th9細胞比例

斑禿組Th9細胞占（1.22±0.14）%，對照組為（1.67±0.18）%，差異有統計學意義（t=2.04，P=0.045），見圖1。斑禿患者Th9細胞比例與疾病活動情況（rs=0.124，P=0.427）、病程（rs=-0.104，P=0.507）及SALT分級（rs=0.020，P=0.901）均無顯著相關性。

表2 不同疾病活動情況、病程及脫發面積斑禿患者的細胞因子水平（±s，ng/L）

表2 不同疾病活動情況、病程及脫發面積斑禿患者的細胞因子水平（±s，ng/L）

注：a P＞0.05；b P＜0.05

分組疾病活動情況活動期穩定期t值病程＜6個月＞6個月t值脫發面積重癥（＞49%）輕癥（≤49%）t值例數白細胞介素9白細胞介素4轉化生長因子β1 γ干擾素56 18 182.60±13.58 214.50±27.94 1.11a 20.92±5.71 15.72±8.79 0.46a 6 466.00±382.50 5 459.00±777.30 1.27a 15.85±3.46 15.31±6.16 0.08a 51 23 186.40±15.37 199.30±20.67 0.48a 15.83±4.98 28.13±10.80 1.19a 6 505.00±427.40 5 417.00±548.20 1.40a 14.29±2.45 18.86±8.06 0.70a 40 34 186.50±15.59 195.00±19.81 0.34a 11.02±2.65 29.81±9.77 1.99a 6 061.00±480.00 6 339.00±535.70 0.39a 9.28±1.94 23.29±5.90 2.40b

圖1 流式細胞儀檢測斑禿患者與對照組外周血單個核細胞中CD4+IL-9+T細胞比例1A：斑禿組；1B：對照組

三、斑禿患者PBMC中Th9相關mRNA表達

斑禿組PBMC中IL-9 mRNA相對含量（1.97±0.18）及PU.1 mRNA相對含量（1.48±0.10）均顯著低于對照組（2.79±0.41、1.89±0.17），差異有統計學意義（t=2.12、2.178，P=0.037、0.032）。Spearman相關分析顯示，斑禿患者PBMC中IL-9 mRNA相對含量與斑禿疾病活動情況（rs=-0.120，P=0.351）、病程（rs=0.034，P=0.794）及SALT分級（rs=-0.071，P=0.579）均無顯著相關性，且PU.1 mRNA相對含量與斑禿疾病活動情況（rs=-0.056，P=0.662）、病程（rs=-0.029，P=0.822）及SALT分級（rs=-0.102，P=0.429）亦無顯著相關性。

討 論

目前大部分學者認同的斑禿免疫學發病機制是生長期毛囊的“免疫赦免”被破壞繼而引起T淋巴細胞介導的自身免疫反應［4］。T淋巴細胞被激活后，分泌大量炎癥因子作用于毛囊，引起毛囊細胞損傷，最終導致毛發的脫落。Th9細胞是最新發現的Th細胞亞型，分泌細胞因子IL-9，其特異性轉錄因子是PU.1。Th9細胞具有多種調節能力，在免疫過程中起著重要作用。IL-9與細胞表面的IL-9受體（IL-9R）結合，激活酪氨酸激酶JAK激酶磷酸化，進一步引起轉錄因子信號轉導和轉錄激活因子（STAT）的磷酸化活化［8］，JAK/STAT信號通路的激活參與多種炎癥性及自身免疫性疾病的發生、發展。IL-9可促進肥大細胞、嗜酸性粒細胞、原始淋巴樣細胞等在皮損部位聚集、活化，參與特應性皮炎的發病［9］。Th9細胞及其效應因子參與銀屑病的免疫病理機制，IL-9可誘導IL-17依賴的銀屑病樣皮膚炎癥及血管增生［10］。另有研究表明［11］，IL-9可能通過對Th17細胞的調節作用在系統性紅斑狼瘡的發病中起重要作用。

本研究顯示，斑禿患者外周血中Th9細胞比例較健康對照組降低，IL-9、PU.1轉錄水平及血清IL-9水平亦降低。Th9細胞的分化及IL-9分泌均需要TGF-β、IL-4及其他協同刺激分子的刺激［12］。本研究結果顯示，斑禿患者外周血中TGF-β1水平顯著高于對照組，而IL-4水平低于對照組，其差異雖未達統計學水平，但其協同其他共刺激分子促進IL-9分泌的作用可能降低。此外，斑禿患者外周血中抑制IL-9分泌的IFN-γ水平明顯升高。這些結果均提示，Th9細胞減少及其相關細胞因子缺乏可能參與了斑禿的發病。目前已明確Th9細胞可歸巢并定植于皮膚組織中［13］，IL-9可促進Treg細胞的存活并增強其抑制功能［14］，而Treg細胞對維持毛囊的免疫耐受狀態有重要作用［15］。因此，我們推測斑禿患者IL-9水平較健康人降低，使患者Treg細胞的抑制功能降低，從而破壞毛囊的免疫耐受狀態，導致脫發的發生。

既往有研究提示［16］，斑禿患者皮損中IL-9基因表達高于對照組，但本研究顯示，斑禿患者外周血IL-9 mRNA和血清水平均低于健康對照組，原因有待進一步研究。本課題組將進一步對大樣本量斑禿患者皮損中Th9細胞及IL-9進行相關研究，探索Th9細胞在斑禿發病中的作用。