基于斑馬魚模型的地塞米松誘導骨質疏松的作用研究

胡佳 田晶晶

（蘇州大學基礎醫學與生命科學學院遺傳學系 江蘇 蘇州 215000）

骨質疏松癥是由于骨組織的代謝紊亂所導致的一種骨密度降低、骨骼礦化量降低，骨折風險增大的一種常見疾病[1]，逐漸成為威脅我國人民生存狀況的一大惡因[2]。地塞米松作為常用抗炎抗過敏藥物，會產生誘發骨質疏松的不良反應[3]，從而影響他的適用范圍。有研究表明斑馬魚幼魚具有完整的成骨與破骨體系，且其關鍵調控基因與人類基因具有同源性[4]。相較于大鼠等模式生物，斑馬魚模型耗時短、實驗成本及實驗難度低、實驗效率高、靈敏度高[5]，適合建立骨質疏松模型并進行藥物高通量篩選。本次實驗為驗證地塞米松對于骨質疏松的誘發作用，同時為探究選擇新的骨質疏松實驗模型，特選擇斑馬魚用作模式生物。建立不同濃度梯度的地塞米松藥物處理組與空白對照組、陰性對照組，觀察不同組別的骨質疏松程度。

1.資料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 斑馬魚成魚（TubABC種系），28℃恒溫，循環水。

1.1.2 實驗試劑 茜素紅S染料；多聚甲醛；地塞米松；高純水。

1.1.3 實驗儀器 ZEISS熒光倒置顯微鏡Axioobserver.A1；生化培養箱SPX-80；Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物的配置 稱取稱取地塞米松以DMSO配置成2000μmol/L的儲備液，再用培養基稀釋成1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培養基。

1.2.2 給藥方法 將3dpf的斑馬魚放入12孔板中培養，每孔5條斑馬魚，每孔加入2ml培養基[6]；自4dpf開始使用含藥培養基培養，將原培養基全部吸凈后每孔加入含藥培養基2ml，空白對照組加入純培養基、陰性對照組加入含0.5%DMSO的培養基、實驗組分別加入1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、15μmol/L、20μmol/L含0.5%DMSO溶液的培養基[7]。每天進行一次半換藥，至9dpf取樣。

1.2.3 茜素紅染色 取培養至9dpf的斑馬魚幼魚，麻醉致死后在4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液中固定2h；洗凈后置于50%乙醇室溫靜置10min；洗凈后使用0.5%KOH配制的茜素紅染色液染色，4℃放置過夜；染色后使用雙氧水與KOH配置的漂白液漂白，后保存至甘油溶液中封片以待觀察[8]。

1.2.4 骨骼礦化量及骨密度分析 用熒光顯微鏡觀察斑馬魚頭部骨骼情況[9]，以同樣的光強度與曝光設置采集圖像并使用Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件分析染色面積與累計光強度。

1.3 統計學處理

用SPSS18.0軟件進行統計學分析。用均數±標準差的形式對計量資料進行表示，行t檢驗，使用χ2檢驗計數資料，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2.結果

2.1 斑馬魚骨密度情況對比

采用Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件觀察染色面積，空白對照組染色面積43463單位，陰性對照組染色面積43073單位，1μmol/L實驗組染色面積41988單位，5μmol/L實驗組染色面積29639單位，10μmol/L實驗組染色面積26327單位，15μmol/L實驗組染色面積23221單位，20μmol/L實驗組染色面積20643單位。1μmol/L實驗組累計光密度較陰性對照組減小不明顯，無統計學意義；5μmol/L～20μmol/L的濃度梯度內斑馬魚骨密度隨地塞米松濃度的增加而減小，組間比較有統計學意義。

2.2 斑馬魚骨礦化量情況對比

采用Image pro plus 6.0專業圖像分析軟件計算累計光密度值（IOD），空白對照組累計光密度16223單位，陰性對照組累計光密度16170單位，1μmol/L實驗組累計光密度15435單位，5μmol/L實驗組累計光密度13227單位，10μmol/L實驗組累計光密度11096單位，15μmol/L實驗組累計光密度9267單位，20μmol/L實驗組累計光密度7653單位。1μmol/L實驗組累計光密度較陰性對照組明顯減小，5μmol/L～20μmol/L的濃度梯度內斑馬魚骨礦化量隨地塞米松濃度的增加而明顯減小，組間比較有統計學意義。

表1 斑馬魚染色面積及累計光密度值對比

3.討論

斑馬魚作為最新的模式動物，其骨骼發育體系與人類骨骼發育類似，均由神經嵴發育而來，具有完整的骨形成與骨吸收體系[10]。同時斑馬魚由于實驗難度小、實驗成本低、靈敏度高等原因，被廣泛用于高通量藥物篩選的模式動物。有研究報道斑馬魚脊柱骨骼骨化機制相較于頭部骨骼骨化機制，與哺乳動物差異較大[11]，故本次實驗選取斑馬魚頭部骨骼進行觀察。

有研究表明，地塞米松可用于誘導骨質疏松的形成從而為抗骨質疏松的藥物篩選提供模型[12]。本次實驗使用不同濃度梯度的地塞米松處理斑馬魚幼魚，得到梯度實驗結果，認為地塞米松誘導的斑馬魚的骨質疏松模型切實可靠，克服了大鼠模型成本高、難度大、靈敏度低的不利因素，適宜用作建立骨質疏松模型。

多次臨床實驗表示地塞米松對患者骨骼發育會產生不良影響[13]，本次實驗也證明了此觀點，為地塞米松的用藥提供了進一步的臨床指導意義。而斑馬魚模型的建立有利于高效快速的抗骨質疏松藥物篩選，期待臨床上骨質疏松的治療效果可以得到進一步的提升。