超高效液相色譜-質譜聯用法測定人血漿中依非韋倫的濃度

陳莉梅，楊亞楠，陶春蕾

安徽中醫藥大學研究生院，合肥230012

依非韋倫（Efavirenz）是一種非核苷逆轉錄酶抑制劑（NNRTI），常與抗逆轉錄病毒藥物聯用，用于治療兒童和成人的艾滋病病毒1型（HIV-1）感染[1]。依非韋倫片主要用于艾滋病患者的抗病毒治療，為國家保障藥物之一。我國目前由Merck Sharp&Dohme（Australia）Pty.Ltd.進口該品種的片劑和膠囊劑，于2016年實現進口藥品國產化。依非韋倫片作為一線抗HIV病毒藥物，臨床需求量大。

國內外依非韋倫血藥濃度的檢測方法主要為高效液相色譜-質譜聯用法（HPLC-MS），但尚未有全面的方法學驗證內容供參考，且方法學驗證中關于溶血及高脂樣品的配制未有詳盡描述。本試驗采用超高效液相色譜-質譜聯用法（UPLC-MS），作蛋白質沉淀的血樣處理，以2015版《中國藥典》為指導，進行了全面的方法學驗證，為依非韋倫臨床藥代動力學研究與方法學驗證提供檢測方法及參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Waters UPLC-API 4000三重四級桿串聯質譜儀，超高效液相色譜儀（美國Waters公司）；API4000質譜儀（美國AB公司）；百萬分之一電子天平（XP6，梅特勒－托利多儀器有限公司）；離心機（G-16C，德國Sartorius公司）。

1.2 藥品與試劑

依非韋倫標準品（USP，純度99.7%，批號R038U0）；內標：依非韋倫-D5［TLC PharmaChem.Inc，純 度96.2%（HPLC）/98.5%（Isotopic Enrichment），批號：1866-041A6，加拿大TLC制藥公司］；乙腈（色譜純，Sigma）；甲醇（色譜純，Sigma）；乙酸銨（分析純，aladdin）。

新鮮血漿由本校附屬醫院提供。

1.3 試驗方法

1.3.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex Gemini C18（2mm×100mm，5μm，110A）；流動相：乙腈-10mmol·L-1乙酸銨（80∶20），等度洗脫；流速：0.25 mL·min-1；柱溫：40℃；樣品盤溫度：4℃；進樣量：2μL。

1.3.2 質譜條件 ESI離子源；負離子模式，多反應監測方式（MRM）測定藥物濃度；離子噴霧電壓為-4200 V，離子源溫度為550℃；依非韋倫及依非韋倫-D5去簇電壓均為-90 eV，入口電壓均為-10 eV，碰撞池出口電壓均為-15eV，碰撞電壓分別為-25eV和-24 eV；用于定量的離子對分別為m/z 314.2→243.9，m/z319.0→247.9。

1.4 血漿樣品處理方法

精密量取血漿樣品50μL于2.0 mL 96孔板中，加入內標工作溶液（2μg·mL-1）50μL，然后加入乙腈200μL，于4℃、4200r·min-1離心10 min。取上清液50μL至干凈2.0 mL 96孔板中，然后加入乙腈200μL，渦旋混勻1 min，于4℃、4200 r·min-1離心10 min，待進樣，進樣量為2μL。

2 結 果

2.1 方法學考察

2.1.1 質譜分析 將依非韋倫、依非韋倫-D5儲備液用甲醇稀釋至1μg·mL-1，采用蠕動泵模式進樣，按“1.3.2”項操作，進行碎片離子分析。圖1為相應的二級全掃描質譜圖。

圖1 依非韋倫（A）、依非韋倫-D5（B）的[M-H]-的二級全掃描質譜圖

2.1.2 專屬性考察 當使用色譜方法測定待測物時，為區分生物基質中干擾的能力，分別取6名受試者的空白血漿各50μL，按“1.4”項下方法操作（不加內標）進樣2μL，得色譜圖2中A、B；將LLOQ（定量下限濃度）水平的依非韋倫和內標依非韋倫-D5溶液加入空白血漿中，同法操作，得色譜圖2中C、D；代表性受試者用藥后，同法操作，得色譜圖2中E、F。依非韋倫和依非韋倫-D5的保留時間均在1.75 min左右，且空白血漿中的內源性物質不干擾依非韋倫和內標依非韋倫-D5的測定。

2.1.3 交叉干擾 為了評估待測物與內標物之間是否存在交叉干擾，分別考察了待測物對內標物的干擾及內標物對待測物的干擾，與同一分析批中LLOQ樣品的內標物或待測物峰面積比較。結果顯示，待測物對內標物干擾為0.0%，內標物對待測物干擾不大于1.0%，說明兩者之間不存在交叉干擾。此項為選擇性考察。

圖2 血漿中依非韋倫及依非韋倫-D5的色譜圖

2.1.4 標準曲線 繪制標準曲線的樣品每天新鮮配制。使用空白基質配制7個濃度水平的標準曲線樣品（每個濃度水平2個重復）。血漿中標準曲線質量濃度為：0.1、0.2、0.5、1、4、7、8μg·mL-1。分別以待測物依非韋倫濃度（X，μg·mL-1）為橫坐標，待測物依非韋倫色譜峰面積（As）與內標物依非韋倫-D5色譜峰面積（Ai）的比值（Y=As/Ai）為縱坐標，用加權（1/X2）最小二乘法進行線性回歸運算，求得的直線方程即為標準曲線。驗證中某批次標準曲線回歸方程為y=0.494x+8.32×10-6（r=0.999 1），線性范圍為0.1～8μg·mL-1，最低定量濃度為0.1μg·mL-1，r>0.99，表明線性關系良好。

2.1.5 定量下限及精密度與準確度 血漿中質量控制（QC）樣品的質量濃度為：0.1μg·mL-1（定量下限濃度，LLOQ）、0.3μg·mL-1（低濃度，LQC）、2μg·mL-1（中濃度，MQC）、6μg·mL-1（高濃度，HQC），以依非韋倫LLOQ、LQC、MQC和HQC四個濃度的質控樣品考察批內及批間精密度與準確度，每一濃度平行制備6個樣品。根據“1.4”項下方法分別處理3批?？疾炝硕肯孪蓿?、中、高濃度水平（LLOQ、LQC、MQC、HQC）下的批內及批間精密度（見表1），表明方法準確性與重現性良好。

2.1.6 提取回收率與基質效應 考察內標工作液濃度（2μg·mL-1）下和待測物低、中、高濃度（0.3、2、6μg·mL-1）下血漿樣品的提取回收率，及待測物低、中、高濃度下血漿樣品的基質效應。按“1.4”項下方法處理低、中、高濃度的血漿樣品，得到提取基質待測物峰面積NEFV及內標物峰面積NIS。將待測物工作液及內標工作液混合，分別配制成0.050/0.333μg·mL-1（待測物/內標）、0.333/0.333μg·mL-1（待測物/內標）、1.000/0.333μg·mL-1（待測物/內標）濃度的中間溶液；將6種不同空白基質經“1.4”項下方法處理得到上清液；取中間溶液50μL，上清液50μL，乙腈150μL，混勻進樣得到未提取待測物峰面積AEFV及內標物峰面積AIS。取上述中間溶液50μL，加入乙腈200μL得到純溶液樣品，進樣得到待測物峰面積均值PEFV及內標物峰面積均值PIS。按下式計算：

結果見表2，提取回收率及基質效應的RSD均＜15%。

表1 依非韋倫的精密度與準確度

表2 依非韋倫提取回收率與基質效應

2.1.7 溶血及高脂效應 溶血及高脂效應屬于基質效應的一種，可能影響分析物的定量。本試驗使用模擬的溶血血漿樣品（加入2%的溶血全血至未溶血的血漿中，視為嚴重溶血）及高脂血漿樣品（在正常空白血漿內加入脂肪乳注射液，至少3mg·mL-1，以甘油三酯含量計算）配制成濃度為0.3、6μg·mL-1的血漿樣品進行評估。結果得溶血及高脂效應的低、高濃度相對偏差在±15.0%范圍內，即溶血及高脂基質效應不影響分析物定量。

2.1.8 稀釋可靠性 在分析過程中，如果待測物濃度高于定量上限，則需要對血漿樣品進行稀釋。為了驗證稀釋質控樣品被稀釋后此樣品仍在測定線性范圍內、且濃度值可接受，用空白血漿配制高于高濃度的稀釋質控樣品（30μg·mL-1）。再用空白健康人血漿5倍稀釋該樣品，平行稀釋6份，稀釋后血藥濃度為6μg·mL-1。稀釋后樣品隨新鮮配制的標準曲線樣品一同測定。測定的濃度乘以稀釋倍數得到相應的稀釋前濃度。進樣后各濃度準確度偏差均在±15.0%范圍內，且精密度（RSD）為2.2%。

2.1.9 儲備液及工作液穩定性 將依非韋倫標準品溶于甲醇中，配制成1 mg·mL-1的儲備液，將依非韋倫儲備液用50%甲醇水溶液分別稀釋成160μg·mL-1和2μg·mL-1工作液，考察依非韋倫儲備液及工作液在室溫放置和0℃～8℃冰箱放置的穩定性，與新鮮配制的依非韋倫儲備液及工作液比較。本試驗測得儲備液室溫放置23h、0℃～8℃放置43d的平均穩定性分別為99.9%、99.6%；工作液室溫放置27 h、0℃～8℃放置43 d的平均穩定性分別為100.4%（ULOQ）、100.5%（LLOQ）和100.4%（ULOQ）、100.3%（LLOQ）。以上結果顯示，質控樣品每個濃度的平均值的準確度均在100.0%±15.0%范圍內，且每個濃度的精密度應均＜15.0%，證明了在考察時間內儲備液及工作液的穩定性良好。

2.1.10 血漿樣品穩定性 取配制后的低濃度（0.3μg·mL-1）、高濃度（6μg·mL-1）血漿樣品50μL，按“1.4”項下方法處理，隨新鮮配制的標準曲線一同測定，每個濃度水平平行測定6份。結果顯示各濃度準確度偏差均在±15.0%范圍內，且精密度RSD均＜15%。驗證了室溫放置24 h穩定性、處理后室溫放置20 h穩定性、處理后0℃～8℃放置99 h穩定性，5次反復凍融（-20℃和-70℃）、長期冷凍穩定性（72 d）及處理后樣品再進樣穩定性（96h）、全血穩定性（室溫及冰浴條件下各放置2h，與放置0 h樣品比較兩者差異的%）等。表明本試驗所開發的方法可以保證不同情況下生物樣品的穩定性。

2.1.11 最大進樣針數 為評估分析批最大進樣針數及方法的耐用性，經驗證分析批最大進樣針數為197針，即在生物樣品分析中各分析批內進樣針數不得超過197針。

2.2 方法學應用

經上海市公共衛生臨床中心倫理委員會審核批準，本試驗招募36名健康受試者（男女比例適當），受試者對本試驗知情同意并簽署知情同意書。受試者隨機分成A、B兩組，每組各18名。實驗為：第一周期18例受試者空腹口服試驗制劑（A藥）600mg，240 mL溫水送服；另外18例受試者空腹口服參比制劑（R藥，STOCRIN?）600mg，240 mL溫水送服；35 d后交叉給藥。

根據原研說明書和調研文獻[2，3]表明，依非韋倫的健康成人的平均消除半衰期為52~76 h，根據《中國藥典》2015版附錄中“化學藥物人體相對生物利用度和生物等效性研究技術指導原則”及2016年國家食品藥品監督管理總局下發的《關于發布普通口服固體制劑參比制劑選擇和確定等3個技術指導原則的通告（2016年第61號）》之附件3“以藥動學參數為終點評價指標的化學藥物仿制藥人體生物等效性研究技術指導原則”等的相關要求及規定，建議藥物人體生物等效性試驗中清洗期一般不應短于7個消除半衰期。參照本品藥動學特征，依非韋倫的健康成人的平均消除半衰期為52~76 h，為了避免上個周期內的處理影響到隨后一周期的處理，因此確定本次生物等效性試驗清洗期為35d，即清洗時間約為840 h，大于7個清除半衰期，完全符合相關要求。采血點為給藥前及給藥后0.5、1.0、1.33、1.67、2.0、2.33、2.67、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、10.0、12.0、16.0、24.0、36.0、48.0、72.0h，共計24個采血時間點。

如圖3所示，為35名受試者（018號受試者第二周期采血脫落，予以剔除，故不進行統計學分析）口服依非韋倫試驗制劑與參比制劑600 mg后的平均血藥濃度-時間曲線。結果表明，本方法測定依非韋倫可用于健康受試者的藥代動力學研究。

圖3 平均藥-時曲線（x±s，n=35）

采用WinNonlin 7.0軟件計算得到依非韋倫人體藥動學參數（見表3），結果顯示，空腹試驗條件下試驗制劑和參比制劑的吸收速度（Cmax和Tmax）和吸收程度（AUC0-72h）相當?？崭菇o藥條件下Cmax、AUC0-72h的幾何均數比值（試驗制劑/參比制劑）的90%置信區間統計結果均在可接受的80.00%~125.00%等效范圍內，分別為96.60%~111.31%、100.76%~109.80%。并經雙單側t-檢驗分析后，P值均＜0.05，即兩制劑在本試驗空腹給藥條件下具有生物等效性。

表3 依非韋倫主要藥動學參數（x±s）

3 討 論

3.1 液相色譜條件及血漿樣品處理方法

依非韋倫Log P=4.6，幾乎不溶于水，故流動相選擇大比例的有機相。文獻[4，5]有使用（甲醇+0.3%甲酸）-（水+0.3%甲酸）（80∶20）及0.1%甲酸水溶液-甲醇（20∶80）作為流動相的，嘗試后發現峰形較差，故嘗試用乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨（85∶15）作為流動相，發現峰形較好，隨后在10 mmol·L-1乙酸銨中分別添加0.1%甲酸及0.1%氨水，發現待測物響應減小，故最終選擇乙腈-10 mmol·L-1乙酸銨（80∶20）作為流動相。文獻[6，7]有使用蛋白沉淀及液液萃取方法處理樣品的，嘗試蛋白沉淀法，發現回收率與基質效應等均能滿足檢測要求，且樣品處理簡便快速。因依非韋倫Cmax較大，定量下限較高，此方法的開發耗時較短。該方法操作簡便、樣品檢測時間短，能達到準確定量及分析的目的。

3.2 采血點設計及受試者例數選擇

由于依非韋倫分布和消除在個體內的變異較小且是一個長半衰期的藥物，所以采用截取AUC來描述藥物吸收的總暴露量，即用AUC0-72h來代替AUC0-t，同時結合WHO《Notes on the design of bioequivalence study：Efavirenz》建議采血周期為72 h，經綜合考慮，最終確定采血周期為72 h。參考該品種相關WHO有關人體生物等效性試驗記載，該品種人體生物等效研究的樣本量在30~48例，依非韋倫片的變異系數20%~25%。通過統計軟件計算受試者例數為19~28例，同時考慮脫落率問題，最終確定受試者人數為36例。

3.3 方法學驗證的完整性

文獻[4，6，8]中關于儲備液及工作液的穩定性考察及溶血與高脂效應的具體操作未見詳盡描述。本試驗對于溶血和高脂樣品的配制進行了描述并進行驗證，還考察了不同貯備條件下待測物及內標溶液的穩定性。針對全血穩定性，大多數文獻未對其進行考察，考慮到臨床采血過程，本試驗考察了室溫及冰浴條件下放置2 h的全血樣品的穩定性。試驗包含了較完整的方法學驗證內容，涵蓋整個臨床采血、樣品運輸及樣本檢測所可能出現的情況，試驗結果顯示，本方法能夠準確定量人血漿中依非韋倫的濃度。