鈣調(diào)磷酸酶抑制劑環(huán)孢素A和他克莫司藥效的監(jiān)測(cè)方法進(jìn)展

姚 婧，林榆杰

泰州市人民醫(yī)院，泰州225300

免疫抑制治療是器官移植術(shù)后抗排斥反應(yīng)的重要措施。鈣調(diào)磷酸酶抑制劑（Calcineurin inhibitors，CNIs）環(huán)孢素A（Ciclosporin A，CsA）和他克莫司（Tacrolimus，Tac）是器官移植術(shù)后最常用的免疫治療藥物，其應(yīng)用大大降低了移植術(shù)后排斥反應(yīng)的發(fā)生，提高了移植器官的生存率[1]。

盡管CNIs是移植藥物史上的重大發(fā)現(xiàn)，但是CNIs的治療窗窄，藥物代謝參數(shù)和藥效的個(gè)體差異大，長(zhǎng)期應(yīng)用易產(chǎn)生毒副作用，如神經(jīng)系統(tǒng)毒性、移植后腫瘤以及各種代謝疾病。臨床上CNIs的劑量調(diào)整主要是使用治療藥物監(jiān)測(cè)（Treatment drug monitoring，TDM），監(jiān)測(cè)CNIs谷濃度結(jié)合患者臨床癥狀進(jìn)行，但這種方法無(wú)法確定初始治療劑量，無(wú)法準(zhǔn)確監(jiān)測(cè)患者實(shí)時(shí)藥效。為此，研究者不斷尋找更多的藥效靶標(biāo)，來(lái)評(píng)價(jià)CNIs的免疫抑制效果，以輔助CNIs的個(gè)體化給藥。本文就目前常用的CNIs藥效監(jiān)測(cè)方法作一綜述。

1 非特異性測(cè)定

CNIs藥效的測(cè)定方法可分為非特異性測(cè)定和特異性測(cè)定。非特異性的藥效參數(shù)是通用的，用于反映移植術(shù)后免疫系統(tǒng)的總體活性。優(yōu)點(diǎn)之一就是可以評(píng)估臨床聯(lián)合用藥時(shí)機(jī)體的整體免疫狀態(tài)。常見(jiàn)的非特異性藥效靶標(biāo)有：T細(xì)胞增殖水平、T細(xì)胞表面抗原、T細(xì)胞亞群、CD4+中ATP水平、抗HLA（human leukocyte antigen，人類白細(xì)胞抗原）抗體以及可溶性CD30（soluble CD30，sCD30）等。

目前臨床應(yīng)用的大部分免疫抑制劑都是通過(guò)抑制淋巴細(xì)胞增殖發(fā)揮作用。Barten MJ等[2]通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定刺激后全血或PBMCs（peripheral blood mononuclear cells，外周血單個(gè)核細(xì)胞）中淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增，來(lái)比較不同濃度下CsA或Tac與霉酚酸酯聯(lián)用時(shí)免疫抑制效果。Kurata Y等[3]使用基于羧基二乙酸酯琥珀酰亞胺酯（Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）的方法，測(cè)定66例服用CsA的腎移植患者的T細(xì)胞增殖水平，發(fā)現(xiàn)患者臨床表現(xiàn)如不良事件的發(fā)生與T細(xì)胞增殖的百分比有較好的相關(guān)性。

此外，Barten MJ等[2]還觀察到各免疫抑制劑聯(lián)用時(shí)增殖細(xì) 胞 核 抗 原 （Proliferating cell nuclear antigen，PCNA）、CD25、CD95或CD154等表達(dá)抑制增強(qiáng)。Stalder M等[4]通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定淋巴細(xì)胞增殖及淋巴細(xì)胞表面抗原CD25、CD71和CD154的表達(dá)，監(jiān)測(cè)腎移植患者的免疫狀態(tài)。

同時(shí)，T細(xì)胞亞群的分化是評(píng)估機(jī)體免疫狀態(tài)的常用方法。移植術(shù)后患者CD4+T細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)過(guò)低易引起嚴(yán)重感染，而CD4+/CD8+過(guò)高則易導(dǎo)致排異反應(yīng)的發(fā)生[5]。劉偉等[6]聯(lián)合檢測(cè)肝移植術(shù)后患者的CD4+T細(xì)胞ATP水平和T淋巴細(xì)胞亞群，發(fā)現(xiàn)排異組受者外周血CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞百分比及CD4/CD8均明顯升高。Martínez C等[7]測(cè)定異基因造血細(xì)胞移植術(shù)后的藥效學(xué)指標(biāo)，發(fā)現(xiàn)CD4+T細(xì)胞ATP水平的升高、CD8+T細(xì)胞升高及CD8+Treg細(xì)胞的降低與移植物抗宿主病顯著相關(guān)。

采用ImmuKnow技術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞ATP水平，可以快速評(píng)估細(xì)胞的免疫功能。多項(xiàng)研究顯示，發(fā)生感染時(shí)，ATP濃度明顯下降，感染控制后恢復(fù)至感染前水平；發(fā)生排斥時(shí)，濃度升高，排斥控制后ATP濃度降至排斥前水平[6，8-10]。

Amirzargar MA等[11]認(rèn)為，移植術(shù)后早期監(jiān)測(cè)HLA抗體、sCD30等生物標(biāo)記物有利于監(jiān)測(cè)腎移植后免疫反應(yīng)。由供體特異性HLA抗體（donor-specific human leukocyte antigen antibodies，DSA）引起的抗體介導(dǎo)的同種異體移植物損傷最近被認(rèn)為是晚期移植物丟失的主要原因之一[12]。CNIs的應(yīng)用有利于阻止DSA的免疫學(xué)作用[13]。

sCD30被認(rèn)為是反映機(jī)體免疫是否處于活化狀態(tài)的靶標(biāo)，可指示急性排斥反應(yīng)的發(fā)生[11，14]。研究證明，移植前后可溶性CD30的提高與急性排斥反應(yīng)的發(fā)生和不良術(shù)后有關(guān)[15]。

綜上，這些非特異性的靶標(biāo)并不僅僅針對(duì)CNIs的藥效，它們反映的是機(jī)體的總體免疫狀態(tài)或細(xì)胞的免疫功能。這些靶標(biāo)的測(cè)定有利于監(jiān)測(cè)移植術(shù)后患者免疫抑制治療的藥效，促進(jìn)CNIs的個(gè)體化用藥。

2 特異性測(cè)定

藥物的藥理作用決定了該藥物的藥效特異性監(jiān)測(cè)方法。對(duì)于CNIs，它主要是通過(guò)抑制T淋巴細(xì)胞內(nèi)的鈣調(diào)磷酸酶（Calcineurin，CaN）活性而發(fā)揮作用。CaN活性的下調(diào)抑制了NFAT（Nuclear factor of activated T-cells，活化T細(xì)胞核因子）的去磷酸化，使NFAT無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞核，從而使NFAT下游基因（如白介素-2、干擾素-γ和腫瘤壞死因子-α等）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)被抑制，產(chǎn)生免疫抑制作用。CNIs藥效通路上其主要的特異性藥效參數(shù)包括：CaN活性、NFAT核轉(zhuǎn)位、細(xì)胞因子釋放水平和細(xì)胞因子基因表達(dá)等。

2.1 CaN活性的直接測(cè)定

傳統(tǒng)的測(cè)定CaN活性的方法有：32P標(biāo)記肽的放射性同位素法、分光光度法、液相色譜法等。

Koefoed-Nielsen PB等[16]通過(guò)測(cè)定32P標(biāo)記肽的放射性同位素法測(cè)定CaN活性，發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞中CaN活性的抑制程度與CsA血藥濃度呈負(fù)相關(guān)。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)Tac和CsA產(chǎn)生的CaN活性抑制效果個(gè)體差異性較大。因此，CNIs的藥效測(cè)定對(duì)于了解CsA和Tac的個(gè)體敏感性是很有必要的。

Sanquer S等[17]通過(guò)分光光度法評(píng)估肺移植后最初2年內(nèi)CaN的活性，發(fā)現(xiàn)當(dāng)酶活性高于102 pmol·mg-1·min-1的上限或低于12 pmol·mg-1·min-1的下限時(shí)，排斥的風(fēng)險(xiǎn)更高。

Carr L等[18]建立了一種液相色譜-多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜法（Liquid Chromatography-TandemMass Spectrometry，LCMRM-MS），通過(guò)測(cè)量合成的磷酸肽底物的去磷酸化來(lái)量化CaN活性。該方法適用于常規(guī)臨床劑量的藥物，有望于大規(guī)模用于臨床，以檢測(cè)CNIs治療患者的CaN活性。

2.2 NFAT核轉(zhuǎn)位測(cè)定

NFAT是參與調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的轉(zhuǎn)錄因子家族。對(duì)NFAT核轉(zhuǎn)位的抑制是CNIs藥效通路上的重要一環(huán)。Maguire O等[19]通過(guò)使用流式細(xì)胞儀的圖像分析系統(tǒng)，定量測(cè)定CD4+和CD8+T細(xì)胞中的NFAT1核轉(zhuǎn)位來(lái)評(píng)估NFAT的激活效應(yīng)，從而確定他克莫司介導(dǎo)的抑制效應(yīng)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，他克莫司對(duì)NFAT1核轉(zhuǎn)位的抑制有劑量依賴性，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)（n=3）也發(fā)現(xiàn)，患者血漿和CD4+中的Tac濃度均與NFAT1核轉(zhuǎn)位的變化相反。這些均表明NFAT1核轉(zhuǎn)位可作為監(jiān)測(cè)Tac藥效的生物靶標(biāo)。

2.3 細(xì)胞因子釋放水平測(cè)定

CNIs通過(guò)抑制白介素-2（Interleukin-2，IL-2）、干擾素-γ（Interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（Tumor Necrosis Factor，TNF-α）等細(xì)胞因子的表達(dá)水平來(lái)抑制免疫反應(yīng)。可通過(guò)測(cè)定移植后患者血清或刺激之后PBMCs中的細(xì)胞因子水平，用來(lái)作為衡量CNIs藥效的間接指標(biāo)。Barten MJ等[20]發(fā)現(xiàn)，CNIs的血藥濃度水平與IL-2的產(chǎn)生緊密相關(guān)。然而，由于不同細(xì)胞所處周期不同，細(xì)胞因子的生存半衰期不同以及細(xì)胞因子表達(dá)上調(diào)、下調(diào)的變化，監(jiān)測(cè)細(xì)胞因子產(chǎn)生有一定的困難。

2.4 細(xì)胞因子mRNA表達(dá)測(cè)定

考慮到直接測(cè)定細(xì)胞因子水平的缺陷，研究人員通過(guò)測(cè)定細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)來(lái)評(píng)估CNIs的免疫抑制效果。

Ha¨rtel C等[21]采用RT-PCR（Reverse Transcription PCR，逆轉(zhuǎn)錄PCR）測(cè)定全血中細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)，用于監(jiān)測(cè)CsA的藥效。研究者發(fā)現(xiàn)，T細(xì)胞刺激后TNF-α的mRNA表達(dá)增加且代謝延緩，這表明炎癥因子mRNA表達(dá)的變化有望成為CsA個(gè)體效應(yīng)的敏感指標(biāo)。該研究團(tuán)隊(duì)同時(shí)還測(cè)定了全血中IL-2 mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Tac單一療法的患者IL-2 mRNA表達(dá)可能與移植術(shù)后排斥相關(guān)[22]。

德國(guó)海德堡大學(xué)的Sommer C團(tuán)隊(duì)建立了一種通過(guò)RT-PCR測(cè)定NFAT下游基因的表達(dá)水平，監(jiān)測(cè)移植患者CNIs藥效的方法[23]。在體外實(shí)驗(yàn)中，在CsA劑量為20 ng·mL-1和200 ng·mL-1時(shí)，測(cè)定經(jīng)刺激后的PBMCs中NFAT各下游基因的mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)IL-2、IFN-γ和GM-CSF（Granulocyte-macrophagecolony-stimulating factor，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子）三種細(xì)胞因子的mRNA表達(dá)變化最為敏感。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，每位個(gè)體患者的NFAT下游基因（IL-2，IFN-γ和GM-CSF）的相對(duì)表達(dá)（Residual gene expression，RGE）相互關(guān)聯(lián)[24]。RGE與CSA或Tac的劑量間有高度的個(gè)體間差異。相反，在治療方案穩(wěn)定的情況下，RGE的個(gè)體內(nèi)差異性相對(duì)較小。

3 CNI藥效監(jiān)測(cè)的臨床研究

盡管越來(lái)越多的CNIs藥效監(jiān)測(cè)方法在不斷出現(xiàn)，但至今為止未有一種方法大規(guī)模用于臨床常規(guī)監(jiān)測(cè)。臨床研究已經(jīng)證實(shí)CNIs藥物濃度和CaN的活性之間的關(guān)系，但關(guān)于CaN活性與移植后臨床結(jié)局之間的關(guān)系研究仍然較少。在器官移植排斥中，CaN的活性與肝移植術(shù)后的臨床結(jié)局有關(guān)[25]。在長(zhǎng)達(dá)兩年隨訪中，Sanque S等[17]發(fā)現(xiàn)在肺移植患者（N=107）中CaN的活性與急性和慢性排斥反應(yīng)有關(guān)。

臨床實(shí)驗(yàn)中，Sommer C團(tuán)隊(duì)以NFAT下游基因（IL-2、IFN-γ和GM-CSF）的相對(duì)表達(dá)監(jiān)測(cè)CsA和Tac的藥效，發(fā)現(xiàn)NFAT RGE可以有效地指示移植術(shù)后患者AR及感染并發(fā)癥的發(fā)生[23，26，27]。通過(guò)監(jiān)測(cè)CsA谷濃度水平和NFAT RGE可以評(píng)估老年患者腎移植術(shù)后的心血管風(fēng)險(xiǎn)、腎功能和其它副作用，如感染、惡性腫瘤[27]等。同樣，通過(guò)NFAT下游基因監(jiān)測(cè)Tac藥效可以指示腎移植患者感染并發(fā)癥的發(fā)生[28]。前瞻性臨床試驗(yàn)（n=22）也證實(shí)，監(jiān)測(cè)NFAT下游基因表達(dá)可以作為肝移植術(shù)后檢測(cè)CNIs藥效的一種可靠措施[29]。此外，一項(xiàng)關(guān)于CsA的大型前瞻性隨機(jī)干預(yù)試驗(yàn)正在進(jìn)行，該項(xiàng)研究是第一個(gè)評(píng)估穩(wěn)定腎移植患者免疫檢測(cè)方法、優(yōu)化免疫抑制效果的隨機(jī)對(duì)照研究。

4 結(jié)論和展望

雖然目前的CNIs的藥效測(cè)定方法多數(shù)仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，到真正應(yīng)用于臨床實(shí)踐還有一段距離；但不可否認(rèn)的是，CNIs藥效的測(cè)定為了解生物效應(yīng)和免疫抑制程度提供了一種新策略，有助于評(píng)估CNIs藥物效應(yīng)。在未來(lái)，CNIs藥效的測(cè)定有望成為輔助TDM、優(yōu)化CNIs個(gè)體化給藥的新措施。