白花蛇舌草水提物通過抑制MAPK通路致肺癌細(xì)胞的凋亡

郭洪梅，趙 丹，曹 琳，夏 輝

徐州市第一人民醫(yī)院 藥學(xué)部，徐州221000

肺癌是發(fā)病率和死亡率增長最快、對人類健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一[1]。近50年來許多國家報(bào)道肺癌的發(fā)病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發(fā)病率和死亡率均占所有惡性腫瘤的第一位，女性發(fā)病率占惡性腫瘤的第二位，死亡率占第二位[2，3]。當(dāng)前肺癌的治療主要是化學(xué)療法和分子靶向治療。化療主要用一些破壞DNA結(jié)構(gòu)和功能的藥物，如順鉑、奧沙利鉑[4]；影響微管合成的藥物長春堿、紫杉醇等[5]。近年來興起的小分子靶向藥物如表皮生長因子（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑（TKs）[6]等。盡管如此，這些藥物的療效十分有限，臨床上對于病人生存期及生活質(zhì)量改善并不盡如人意，肺癌的治療現(xiàn)狀仍然堪憂。相比而言，中醫(yī)藥由于其成分復(fù)雜，往往具有多靶點(diǎn)、多重功效且副作用小的特征而越來越被人們重視[7]。目前已有多種中草藥被作為主要或輔助藥物用于肺癌的治療[8]。

白花蛇舌草為茜草科耳草屬植物白花蛇舌草（Hedyotis diffusa Willd）的干燥全草，又名蛇舌草、蛇利草、蛇總管、二葉葎等[9]。白花蛇舌草主要分布于浙江、江西、福建、湖北、廣東及西南等地，具有清熱解毒、活血化瘀、利濕通淋等作用，常用于治療腫瘤、黃疸型肝炎、胃腸炎、肺炎等疾病[10]。白花蛇舌草具有明顯的抗腫瘤活性，臨床上經(jīng)常用于治療各種癌癥，如胃癌、直腸癌、惡性淋巴瘤、子宮頸癌、卵巢癌、膀胱癌等消化道、生殖系統(tǒng)、淋巴系統(tǒng)的癌癥[11]。

目前，對于白花蛇舌草抗腫瘤物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制的研究已取得了一些成績，但是白花蛇舌草抗肺癌的療效和分子機(jī)制尚不明確，嚴(yán)重制約著白花蛇舌草的臨床應(yīng)用[12]。因此有必要對白花蛇舌草抑制肺癌的作用機(jī)制進(jìn)行深入、系統(tǒng)的研究，為白花蛇舌草開發(fā)成肺癌治療藥物提供理論基礎(chǔ)。本研究通過體內(nèi)體外研究深入探討了白花蛇舌草（BHSSC）水提物的抗腫瘤療效及其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)了其促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路，將為闡明白花蛇舌草的抗肺癌機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 細(xì)胞株

人肺癌細(xì)胞株A549和PC-9細(xì)胞，購于上海中科院細(xì)胞庫；7-氨基放線菌素D（7-AAD，美國BD公司）。

1.2 動(dòng)物

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號(hào)：201810896。

1.3 藥品與試劑

肺癌治療陽性藥順鉑（CDDP，美國MCE公司，No：HY-17394），溶于二甲亞砜（DMSO）中制成濃度為20 mmol·L-1的儲(chǔ)備液，貯存于-20℃冰箱，稀釋后用于實(shí)驗(yàn)；MTT（美國Sigma公司）；RMPI-1640培養(yǎng)基粉末、DMEM培養(yǎng)基粉末、胰酶（0.25%Trypsin-EDTA）、胎牛血清、青霉素加鏈霉素（美國Gibco公司）；PE Annexin V凋亡檢測試劑盒（美國BD Pharmingen公 司，Lot：7026588）；Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38抗體（美國CST公司）；EDTA（乙二胺四乙酸，國藥集團(tuán)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 白花蛇舌草（BHSSC）水提物的制備

白花蛇舌草30 g加入10倍量沸水提取3次，每次1 h，提取液經(jīng)紗布過濾后混合，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至100 mL，0.22μmol·L-1過濾除菌后置于4℃保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用藥劑量按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與成人體表面積比等效量核算比率，計(jì)算動(dòng)物的等效劑量。實(shí)驗(yàn)時(shí)以去離子水配制成所需濃度，放4℃冰箱保存。

2.2 MTT法檢測BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞的增殖活力的影響

MTT法用于檢測不同候選藥物對2種肺癌細(xì)胞株A549、PC-9細(xì)胞的增殖抑制作用。取對數(shù)生長期的細(xì)胞以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中。BHSSC水提物按照預(yù)設(shè)的藥物濃度加藥（0、50、100、200、300、400、500、600μg·mL-1），各組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。200μg·mL-1BHSSC水提物處理A549、PC-9細(xì)胞不同時(shí)間（0、6、12、24、48、72和96h），藥物處理時(shí)間結(jié)束后，每孔加入濃度為5g·L-1的MTT 10μL，37℃培養(yǎng)箱孵育4 h后，吸取上清液，每孔加入DMSO 100μL于振蕩器上溶解10 min，測定A570nm/A630nm值并計(jì)算增殖抑制率。 增殖抑制率 （%）=（Atest570nm-Atest630nm）/（AControl570nm-AControl630nm）×100%。

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測BHSSC水提物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡

取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞株A549、PC-9細(xì)胞，以1×105個(gè)/mL的密度種入6孔板后于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長到80%融合度后分別加入不同濃度的BHSSC水提物（0、200、400μg·mL-1）處理48 h。到達(dá)時(shí)間點(diǎn)后用不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用PBS洗滌細(xì)胞2次（2 000 r·min-1離心5 min），收集1×105個(gè)細(xì)胞；加入結(jié)合緩沖液懸浮細(xì)胞100μL；加入Annexin V-PE（PE標(biāo)記的膜磷脂結(jié)合蛋白V，美國BD公司）5μL混勻后，加入7-AAD 5μL，混勻。室溫、避光、反應(yīng)15 min后，用流式細(xì)胞儀檢測（GUAVA Easy Cyte，Millipore，US）肺癌細(xì)胞凋亡效果。

2.4 Western blot法檢測BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路的影響

取對數(shù)生長期的肺癌細(xì)胞株A549和PC-9細(xì)胞，以2×105個(gè)/mL的密度種入6孔板后于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞長到80%融合度后分別加入不同濃度的BHSSC水提物（0、100、200、400μg·mL-1）處理48 h，并以20μmol CDDP作為陽性對照。在冰上用裂解緩沖液RIPA裂解細(xì)胞30 min，提取全蛋白，加入上樣緩沖液，用煮樣器煮沸3min后，上樣用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，再以100V轉(zhuǎn)膜1h，用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵育一抗（1∶1000稀釋）于4℃孵育過夜，用TBST（含0.1%吐溫-20）漂洗4遍（間隔10 min）后，二抗（1∶10 000稀釋）孵育1 h，經(jīng)TBST漂洗4遍后于ECL曝光顯影，曝光Erk、p-Erk、JNK、p-JNK、p38、p-p38等目的條帶，用Image J軟件對曝光的條帶的相對灰度值進(jìn)行計(jì)算并統(tǒng)計(jì)。

2.5 裸鼠移植瘤模型檢測BHSSC水提物對體內(nèi)肺癌生長的抑制活性

全雌性BALB/c（Nu/Nu）裸鼠，3~4周齡，體重（14±2）g，適應(yīng)飼養(yǎng)一周后，根據(jù)體重平均分為模型組、BHSSC給藥組（10 mg·kg-1）和陽性藥順鉑組（1 mg·kg-1）三個(gè)組，每組7只動(dòng)物；取生長良好的A549細(xì)胞使用預(yù)冷PBS洗滌后消化，再用預(yù)冷PBS洗滌兩次后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度與基質(zhì)膠1∶1混合成濃度為2×107/mL的細(xì)胞懸液，放置于冰上備用；采用皮下注射方法，以0.2 mL/只的量接種于裸鼠右前肢腋下；造模3天后，腹腔注射給藥，每兩天記錄裸鼠體重、瘤體積（瘤體積按V=0.5×a×b2公式計(jì)算，其中a為腫瘤長徑，b為腫瘤短徑）；給藥21天后處死小鼠，終止實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 MTT法檢測BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞增殖的影響

為了驗(yàn)證候選BHSSC對肺癌細(xì)胞增殖的影響，本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測不同BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞A549、PC-9的增殖抑制作用。作用48 h后，結(jié)果如圖1A所示，BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞有顯著的劑量依賴的增殖抑制作用，當(dāng)濃度達(dá)到600 μg·mL-1時(shí)抑制率超過95%，對A549細(xì)胞的IC50為287μg·mL-1，PC-9細(xì)胞的IC50為326μg·mL-1。并且隨著作用時(shí)間的延長，BHSSC水提物的作用越顯著（圖1B）。給藥濃度達(dá)到400μg·mL-1時(shí)，A549細(xì)胞和PC-9細(xì)胞發(fā)生明顯皺縮變圓（圖1C）。

圖1 白花蛇舌草對肺癌細(xì)胞株A549和PC-9細(xì)胞的增殖抑制活性。

3.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞凋亡的影響

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞術(shù)檢測BHSSC水提物誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡活性。如圖2所示，不同濃度BHSSC水提物處理A549細(xì)胞和PC-9細(xì)胞48 h后，PE+/7-AAD細(xì)胞增多，即細(xì)胞開始發(fā)生凋亡。綜合分析發(fā)現(xiàn)，BHSSC水提物能劑量依賴性促進(jìn)兩種肺癌細(xì)胞的凋亡。

3.3 荷瘤裸鼠模型檢測BHSSC水提物體內(nèi)抗肺癌活性

如圖3所示，通過荷瘤裸鼠實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)BHSSC水提物有顯著的延緩腫瘤生長活性，與模型對照組相比，差異顯著（P<0.01）。并且BHSSC水提物對小鼠體重幾乎沒有影響（P>0.05），提示其毒副作用較弱。

3.4 BHSSC水提物對MAPK通路的影響

如圖4所示，BHSSC水提物能夠顯著降低A549細(xì)胞MAPK通路中關(guān)鍵蛋白Erk、p38、Junk的表達(dá)和磷酸化水平，從而抑制MAPK通路的活化，最終誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞凋亡，并且400μg·mL-1的凋亡誘導(dǎo)效果與20μmol CDDP的效果相當(dāng)。

4 討 論

中藥抗腫瘤以其具有多靶點(diǎn)、多重功效顯著、毒副作用小等特點(diǎn)日益受到國內(nèi)外學(xué)者的重視。白花蛇舌草是我國傳統(tǒng)中藥，是臨床治療腫瘤的有效藥物。近年來開展了大量的臨床和基礎(chǔ)研究工作來揭示其抗腫瘤機(jī)制和物質(zhì)基礎(chǔ)。但是白花蛇舌草對肺癌的治療效果尚缺乏足夠的臨床數(shù)據(jù)支撐，且其對肺癌的抗腫瘤活性目前也大多處于實(shí)驗(yàn)研究階段，抑制肺癌的分子機(jī)制尚未明確。

促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAP激酶，MAPK）鏈?zhǔn)钦婧松镄盘?hào)傳遞網(wǎng)絡(luò)中的重要途徑之一，在基因表達(dá)調(diào)控和細(xì)胞質(zhì)功能活動(dòng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[13]。MAPK有4個(gè)主要亞族：ERK、JNK、p38MAPK和ERK5。MAPK可促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和新血管生成[14]。新血管生成后可為腫瘤提供更多的營養(yǎng)，加速腫瘤的生長，促進(jìn)癌細(xì)胞的擴(kuò)散。MAPK通路的異常活化與腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲密切相關(guān)。因此MAPK通路可作為抗腫瘤靶點(diǎn)而被廣泛研究。本研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草水提物對兩種肺癌細(xì)胞有一定的殺傷作用。當(dāng)藥物達(dá)到一定濃度時(shí)，BHSSC水提物對肺癌細(xì)胞有顯著的劑量依賴的增殖抑制作用。當(dāng)濃度達(dá)到600μg·mL-1時(shí)抑制率超過95%，對A549細(xì)胞的IC50為287μg·mL-1，PC-9細(xì)胞的IC50為326μg·mL-1；并且隨著作用時(shí)間的延長，BHSSC水提物的抑制作用越顯著。通過荷瘤小鼠實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BHSSC水提物也具有顯著的體內(nèi)抗肺癌活性，給藥22天后，腫瘤生長抑制率達(dá)到65%。此外連續(xù)給藥對動(dòng)物體重?zé)o顯著影響，提示BHSSC水提物的毒副作用較弱。進(jìn)一步探索發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草水提物能顯著抑制MAPK通路中關(guān)鍵分子ERK、jnk、p38的磷酸化表達(dá)，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡及抑制腫瘤的生長和侵襲。

本研究可為闡明白花蛇舌草抑制肺癌的分子機(jī)理提供理論參考，并且為白花蛇舌草研發(fā)成具有中醫(yī)藥特色的肺癌治療藥物提供依據(jù)。

圖2 白花蛇舌草處理后引起肺癌細(xì)胞株A549和PC-9細(xì)胞凋亡

圖3 白花蛇舌草體內(nèi)抗腫瘤活性

圖4 白花蛇舌草對細(xì)胞凋亡相關(guān)MAPK通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)及磷酸化的影響