作物淀粉的三維熒光光譜指紋分析鑒定方法

張晉丹 吳明偉 馮曼

摘要：采用淀粉固體粉末進行熒光光譜測定，并對三維熒光光譜（EEMs）進行平行因子分析（PARAFAC），研究了水稻、高梁、玉米等單子葉作物淀粉的熒光組分特征，探討了熒光組分特征與水稻品種的相關性。結果表明：不同來源的淀粉具有不同的熒光特性，可作為該物種淀粉的指紋圖譜;秈稻熒光組分的熒光強度明顯低于粳稻，經過單因素方差分析，可確定秈稻和粳稻的淀粉熒光組分強度具有顯著差異，說明該方法可用于秈粳稻淀粉的鑒別。

關鍵詞：淀粉;三維熒光光譜;平行因子分析;指紋圖譜

中圖分類號：0657.3;Q539+.1 文獻標志碼：A

引言

淀粉是植物的主要能量儲藏物質，由直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。直鏈淀粉是由葡萄糖殘基以a-1，4糖苷鍵連接而成，基本上呈線型。支鏈淀粉由許多小的直鏈分子組成，不同的小直鏈分子間以a-1，6糖苷鍵連接，形成分支。直鏈淀粉和支鏈淀粉所占比例以及支鏈淀粉的分支度決定淀粉的品質和用途。研究表明，淀粉是一種熒光物質，不同來源作物的淀粉結構存在較大差異，構成不同作物特征性淀粉熒光指紋圖譜。

三維熒光光譜（EEMs）技術作為一項有效的化學分析手段，具有速度快、取樣量少、信息量大、靈敏度高等特點，在水質分析、綠茶成分鑒定、黃曲霉毒素等檢測中發(fā)揮著重要的作用。平行因子分析（PARAFAC）方法是一種針對三維復雜數據的分析方法，能夠最大限度表征樣品中所有的熒光信息，將熒光信號分解成相對獨立的熒光矩陣，提高了分析的準確性。目前三維熒光光譜技術結合平行因子分析方法已經成為研究水環(huán)境中有機物溶解動力學特征的重要工具。由于淀粉不溶于水和有機溶液，文獻【3】采用淀粉懸液進行熒光光譜測定，但光譜的均一性問題限制了淀粉熒光分析方法的普遍應用。

本文采用淀粉固體粉末進行熒光光譜測定，對三維熒光光譜進行平行因子分析，研究水稻、高粱、玉米等單子葉作物淀粉的熒光組分特征，建立不同作物的熒光指紋圖譜，并初步探討了熒光組分特征、表觀直鏈淀粉含量（AAC）及水稻品種的相關性。

1測量方法

1.1三維熒光光譜測量

收集不同地區(qū)水稻品種53份、高粱品種14份、玉米品種18份。將成熟水稻種子加工成精米后粉碎，再經37℃烘烤1周后過100目篩子，備用。將高粱和玉米直接粉碎，37℃烘烤一周后，過100目篩子，備用。

采用日立公司F-7000熒光光度計進行三維熒光光譜測定，配以固體支架（零件號：650-0161），掃描速度為2400mm/min，激發(fā)和發(fā)射單色儀的狹縫設定為5mm，激發(fā)波長和發(fā)射波長的范圍為200～900mm，步長為10mm。將采集到三種植物的三維熒光光譜數據存儲在Excel表中，并存儲為f1.CSV形式。采用DOMFluor工具包在MATLAB 2007a軟件上對待測樣品三維熒光光譜數據進行平行因子分析，分析中設置非負性限制，去除瑞利和拉曼散射，并去除離群樣品，對剩余樣品的三維熒光光譜數據構建成相應作物的淀粉熒光組分數據庫。熒光組分的數目由折半分析法確定（split-half analysis），每一熒光組分的特征由組分EEMs表示，每個熒光組分在每個樣品中的熒光強度以Fmax（RU）表示。

1.2水稻精米粉表觀直鏈淀粉含量測定及統計分析

準確稱量10mg精米粉置于2mL離心管，加入100ul的無水乙醇，震蕩混勻，再加入900ul濃度為1 mol/L的氫氧化鈉溶液，震蕩混勻后放入30℃培養(yǎng)箱靜置16 h使精米粉糊化。4份水稻不同表觀直鏈淀粉含量的標準樣品（1.5%，10.2%，16.2%，26.4%）購于中國農科院水稻研究所（杭州），對這4份水稻按同樣的方法同時進行糊化。

經糊化后的樣品溶液與1 mL去離子水震蕩混勻，取10ul稀釋后的糊化溶液與990ul碘/碘化鉀溶液（20/0）混勻靜置20 min;然后吸取200ul反應液加入96孔透明細胞培養(yǎng)皿中，利用酶標儀（infinite M200 PRO）進行測定，測定波長為680 nm。采用SPSS軟件進行相關性分析，以及單因素方差分析。

2結果與討論

2.1水稻精米淀粉的熒光組分

根據PARAFAC模型，識別出水稻精米淀粉中有4個熒光組分（component，c），其中c1和c2為強熒光組分，如圖1所示，圖中Ex為激發(fā)光譜，Em為發(fā)射光譜。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個激發(fā)峰，組分c1（200，280/310 nm），組分C2（250，360/440nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個激發(fā)峰和3個發(fā)射峰，組分C3（290，430/455，570，880nm），組分C4（270，410/480，550，820 nm）。

2.2高梁淀粉的熒光組分

根據PARAFAC模型，識別出高粱淀粉中有4個熒光組分，其中c1和c2為強熒光組分，如圖2所示。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個激發(fā)峰，組分C1（200，270/290 nm），組分C2（250，340/420 nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個激發(fā)峰和3個發(fā)射峰。組分C3（270，400/430，520，800 nm），組分C4（290，430/430，560，860 nm）。

2.3玉米淀粉的熒光組分

根據PARAFAC模型，識別出玉米淀粉中有4個熒光組分，其中c1和c2為強熒光組分，如圖3所示。組分c1和c2包括單一發(fā)射峰和2個激發(fā)峰，組分C1（200，270/310 nm），組分C2（240，360/440nm）。組分c3和C4是弱熒光組分，含有2個激發(fā)峰和3個發(fā)射峰，組分C3（270，400/430，530，810nm），組分C4（290，430/450，570，880 nm）。

從3種作物的三維熒光光譜可以看出，不同來源淀粉的特征性熒光組分存在偏移和重疊現象。相對于高梁和玉米，水稻淀粉組分c2的熒光信號較弱。高粱淀粉組分c2的發(fā)射波長為420 nm，水稻和玉米淀粉組分c2的發(fā)射波長為440 nm。水稻組分c3的激發(fā)和發(fā)射波長發(fā)生紅移等。因此，通過比較這些特征性熒光組分的波長和熒光強弱可以區(qū)分不同來源的淀粉。

2.4水稻熒光組分強度分布與亞種的相關性

為了研究淀粉熒光組分與水稻亞種的相關性，我們分析了不同水稻品種的熒光組分強度和粳秈稻亞種的相關性，不同水稻的熒光強度測定結果如表1所示。研究表明，秈稻熒光組分的熒光強度明顯低于粳稻的，經過單因素方差分析，確定秈稻和粳稻的淀粉熒光組分強度具有顯著差異，其中熒光組分2顯著性p值小于0.01、熒光組分3顯著性p值小于0.01、熒光組分4顯著性p值小于0.05，如表2所示。

2.5水稻熒光組分強度分布與表觀直鏈淀粉含量的相關性

直鏈淀粉含量是水稻重要的品質性狀之一，一般用表觀直鏈淀粉含量（AAC）來表征。為了確定熒光組分和直鏈淀粉的相關性，進一步測定了這些品種的表觀直鏈淀粉含量（AAC）如表3所示，分析了水稻熒光組分強度與表觀直鏈淀粉含量（AAC）的關系。經SPSS軟件統計分析，Pearson相關系數低于0.2，顯著性p值雙側大于0.05，說明兩者之間沒有相關性，如表4所示。

3結論

本文建立了固體樣品淀粉熒光光譜測定方法，并通過指紋圖譜區(qū)分不同來源的淀粉。這種測定方法不但可以避免淀粉熒光測量時面臨的溶質不均性問題，而且可以避免有機溶液產生的背景熒光，提升了測定方法的靈敏度和結果重現性。另外相對于主成分分析等二維數據分析方法，利用平行因子分析方法進行三維數據分析，其解是唯一的，也可以避免主觀因素造成的分析結果差異。因此，作為一種新的淀粉測試分析方法，本研究能夠為不同來源的淀粉鑒定提供參考。