超聲波輔助對乳化交聯工藝制備絲素蛋白微球形貌的影響

王宗乾，王鄧峰，周 杭，李 俊

(1.安徽工程大學 紡織服裝學院，安徽 蕪湖 241000；2.安徽工程大學 安徽省紡織印染行業技術中心，安徽 蕪湖 241000)

絲素是蠶絲的主體成分，其質量約占蠶絲總質量的70%～80%[1]，作為一種天然蛋白質資源，具有良好的生物相容性和生物降解性能[2]，因此絲素蛋白在生物醫藥、組織工程等領域的應用受到了較多關注。同時，基于絲素蛋白的結構與反應特性，可將其設計加工制備薄膜[3]、凝膠[4]、多孔材料、納米纖維、微球等不同形貌的產品[5-7]，具有豐富的可改造空間。應用于生物醫藥領域的微球通常是以高分子材料為載體，包裹或吸附藥物而制成的微小球狀實體，粒徑范圍分布在1～300 μm區間[8]。有研究表明，微球粒徑是衡量其效能的重要指標，隨著粒徑的減小，微球的比表面積增加，有助于提升微球表面的吸附量，提高光散射比率等[9]；微球粒徑減小也將導致分布在微球表面的相對原子數增多，致使微球表面能增加[10]；同時基于凝膠粒子體積改變的弛豫時間與其半徑的平方成正比理論，粒徑越小的微球對外界刺激的反應速度更快[11]。絲素蛋白微球應用于生物醫藥領域具有藥物緩釋作用，在慢性病治療、創傷修復等領域具有廣闊的應用前景[12]。綜上，微球的制備是開發和利用絲素蛋白微球的首要環節，微球粒徑的分布將直接影響其性能。潘岳林等[13]采用自組裝方法制備了絲素蛋白微球，研究發現隨著絲素蛋白質量分數的增加，微球粒徑增大，微球也將發生集聚。楊道偉[14]以乳化交聯工藝制備了絲素蛋白空白微球，并對影響微球粒徑的工藝因素進行探討。王鼎等[15]以自組裝方法制備了絲素蛋白微球，并以此為模板制備介孔二氧化硅(SiO2)空心微球，在其研究中發現，不同體積比制備的絲素蛋白微球出現粘黏現象。

眾所周知，超聲波具有聲空化效應，已廣泛應用于化學化工、生物醫藥、紡織印染等領域[16-18]。當前已有學者將超聲波技術應用于微球結構的調控：郭生偉等[19]利用超聲輻照引發包覆乳液聚合制備了聚丙烯酸正丁酯(PBA)空心微球，透射電鏡(TEM)和動態光散射(DLS)測試結果顯示，空心微球粒徑均一，殼層厚度均勻；汪衍濤等[20]以電火花-超聲復合加工法制備鎳微球，結果表明加入超聲波之后，小粒徑(0～10 μm)鎳微球比例明顯升高，且小粒徑微球比例隨著超聲波頻率的增大而降低，隨著超聲波功率的增大而升高；王偉華等[21]以異丙氧基鈦(TITP)為原料，利用超聲波輔助溶膠/凝膠法制備微米級多孔性二氧化鈦微球，結果表明超聲波輔助可減小微球粒徑，進一步提高微球比表面積。綜上所述，超聲波輔助工藝有助于降低微球的平均粒徑并有利于微球的均勻分布。

已有文獻同時表明，不同的脫膠、溶解等工藝對絲素蛋白結構與性能產生顯著影響，其中尿素脫膠工藝、氯化鈣/乙醇/水三元體系溶解對絲素蛋白結構的影響較弱，可提取低損傷的絲素蛋白[22-23]。以尿素脫膠工藝提取的絲素蛋白為原料，采用乳化交聯工藝制備絲素蛋白微球極易發生黏連團聚現象，微球粒徑分布不勻。目前還沒有超聲波輔助乳化交聯工藝制備絲素蛋白微球的報道。本文采用尿素脫膠、溶解等工藝制備了絲素蛋白，并結合電泳圖譜分析其分子量分布；基于乳化交聯工藝制備了絲素蛋白微球，并對其粒徑、形貌進行表征；在此基礎上，設計了超聲波輔助乳化交聯工藝制備微球的方案，采用激光粒度分析儀、掃描電鏡(SEM)分別對超聲輔助前后制備微球的粒度分布和形貌特征進行測試與表征，并通過超聲頻率和功率的調節，探討了超聲波輔助對乳化交聯工藝制備絲素蛋白空白微球粒徑分布、形貌的影響規律，以期為微球粒徑的調控及均勻絲素蛋白微球的制備提供實驗基礎。

1 實驗部分

1.1 材料與試劑

蠶生絲(安徽青陽縣三方絲綢有限公司)；尿素(南京化學試劑有限公司)；無水乙醇(上海泰坦科技股份有限公司)；異丙醇、石油醚、非離子表面活性劑Span 80、無水氯化鈣、50%戊二醛、液狀石蠟、聚合度為20 000聚乙二醇(上海阿拉丁試劑有限公司)。以上試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1絲素蛋白的制備

蠶生絲經脫膠、溶解、透析、濃縮等工序后，制得了實驗所需的絲素蛋白液。具體操作如下：精確稱取一定質量的蠶絲并按1∶30的浴比將其浸漬于8 mol/L的尿素溶液中，在100 ℃下脫膠3 h，取出并經去離子水沖洗至無滑膩感，于40 ℃烘箱內烘至質量恒定制得尿素脫膠蠶絲；取2 g脫膠蠶絲按1∶20的浴比浸漬于預先配制的CaCl2/C2H5OH/H2O三元溶劑(三組分的量比為1∶2∶8)中，在50 ℃下先溶脹2 h，后升溫至85 ℃，恒溫振蕩溶解2 h，得到絲素蛋白溶解液；絲素蛋白溶解液經離心(轉速 6 000 r/min，時長10 min)處理，將上層清液注入透析袋(截留分子質量8 000～14 000 kDa)中進行透析，透析持續3 d，每間隔4～6 h換水；經聚乙二醇濃縮制得質量分數為4%的絲素蛋白液，備用。

1.2.2微球乳化交聯制備工藝

量取40 mL液狀石蠟與4 mL的Span 80攪拌混合40 min，用移液槍緩慢滴加4%的絲素蛋白溶液3.6 mL，在400 r/min條件下繼續攪拌40 min形成均勻穩定的油包水(W/O)型乳液后，緩慢滴加50%戊二醛1.2 mL，持續攪拌3 h，低速離心，倒出上層清液，用石油醚、異丙醇多次洗滌，干燥，收集微球。

1.2.3超聲波輔助微球制備

在乳化交聯工藝制備微球的乳化階段加以超聲波輔助，施加的超聲波頻率在28、45、80 kHz 3檔可調，功率可在40、60、80、100 W 4檔可調，超聲波作用時間均為5 min，溫度為室溫；超聲波輔助工藝中，微球制備的乳化時長縮短至5 min。

1.3 測試方法

1.3.1蠶絲脫膠率

采用稱重法計算蠶絲脫膠率。具體操作如下：脫膠前后蠶絲樣品于40 ℃ 烘箱調查間距干至質量恒定，后放入干燥器中平衡24 h，精確稱量，并按下式計算脫膠率。

式中:R為脫膠率，%；m1為脫膠前蠶絲質量，g；m2為脫膠后蠶絲質量，g。

1.3.2絲素蛋白分子質量分布

采用SDS-PAGE凝膠電泳方法測試本實驗制備絲素蛋白的分子質量分布；具體操作同文獻[22]所述。

1.3.3微球粒徑分布

采用Nano ZS90納米激光粒度儀(英國Malvern公司)對制備微球的粒徑分布進行分析，測試前將各微球樣品分散于超純水，粒徑測試區間設定為0.02～2 000 μm。

1.3.4微球形貌觀察

用吸管吸取少量干燥微球平鋪于附有導電膠的載物臺上，表面噴金，將絲素蛋白微球置于電鏡臺，采用S-4800掃描電子顯微鏡(日本Hitachi公司)檢測微球表面形貌。

2 結果與討論

2.1 尿素脫膠蠶絲及絲素蛋白性能

采用相同的尿素脫膠工藝，平行對5組蠶生絲進行脫膠處理，測試脫膠率數據在27.56%～28.36%之間，平均值為27.87%，標準偏差值為0.30。該脫膠率值稍低于傳統的碳酸鈉脫膠數據，但與文獻所述不同工藝脫膠數據基本吻合[24]，同時27.87%的脫膠率值也與絲膠在蠶絲中的質量分布相對應[1]；尿素脫膠機制在于對絲膠組分的吸濕溶脹，促進絲膠蛋白的溶解，尿素脫膠體系不呈堿性，對絲素蛋白結構與分子量不產生影響，這也是尿素脫膠工藝制備低損傷絲素的緣由。此外，在尿素脫膠平行實驗中，脫膠率標準偏差值小，表明不同批次之間在脫膠率上不存在顯著差異，該工藝穩定且易于控制。尿素脫膠蠶絲保留了原有的蠶絲光澤，其藍光白度值大于70%，該數值高于傳統碳酸鈉脫膠所得蠶絲的白度值(68.43%)[22]，這可能與絲素蛋白在堿性環境中易于發生光氧化黃變及蛋白質變性相關。

尿素脫膠蠶絲經溶解、離心、透析處理，制得絲素蛋白液，實驗對其進行了SDS-PAGE凝膠電泳分析，結果如圖1所示。

圖1 絲素蛋白分子質量分布Fig.1 Molecular weight distribution of silk fibroin.(a) Original image; (b) Schematic diagram

脫膠蠶絲可由CaCl2/C2H5OH/H2O三元體系完全溶解，得到淡黃色溶液，離心后底部有痕量的黑色物質，判斷為氯化鈣藥劑所含雜質；經透析后，絲素蛋白液呈半透明乳白色，沒有絲素蛋白析出及團聚現象。由圖1可知，制備的絲素蛋白集中分布在40～100 kDa區間，此外在稍低于31.0 kDa以及稍高于14.4 kDa處也有分布，這與絲素蛋白由輕鏈和重鏈2種蛋白構成密切相關。由此可見尿素脫膠沒有致使重鏈絲素蛋白水解，保留了絲素蛋白原有的分子量分布。文獻研究表明，分子量較大的絲素蛋白更易成膜成球，且成膜結構較為穩定，具有更好的耐熱和機械穩定性能，有助于提升微球的穩定性能[25]；在微球制備與應用中，微球形貌的穩定性至關重要，為此尿素脫膠為獲取大分子的絲素蛋白提供了有效途徑。

2.2 乳化交聯工藝制備的空白微球

圖2示出乳化交聯工藝制備微球的粒徑分布。由圖可知，微球粒徑集中分布于10～20 μm區間，平均粒徑為15.48 μm，微球粒徑分布的標準偏差值為0.515。采用SEM對微球形貌進行表征，如圖3所示。發現微球呈現了較為嚴重的集聚和粘連形貌，形成了多個較大尺寸的微球集聚體，這和微球粒徑分布測試數據并不相符。分析致使微球集聚和黏聯的原因在于乳化交聯工藝中，因大分子的絲素蛋白具有較強的自聚集效應，且極易成膜[25]，在乳化交聯工藝的機械攪拌條件下，大分子絲素蛋白分散不均勻，致使形成的單個微球形貌并不完整，即絲素蛋白在單個微球上并未形成完整且穩定的球壁，在烘干過程中，微球球壁相互之間重新發生黏結，并形成較大的聚集體。在粒徑分布的測試中，需要將微球分散在水介質中，且介質中蛋白微球的質量濃度很低(小于0.01%)，微球之間碰撞接觸的機會較小，難以形成集聚體，因此僅憑微球粒徑測試數據尚不能全面反映制備微球的真實形貌。為解決這一問題，必須在乳化交聯制備微球的工藝中，促使絲素蛋白均勻分散，并保證微球形貌的完整，避免干燥過程中球壁絲素蛋白發生再次聚集。

圖2 空白微球粒徑分布圖Fig.2 Particle size distribution of blank microspheres

圖3 空白微球形貌Fig.3 Morphology of blank microspheres.(a) Microsphere aggregation(×500); (b) Amplification of microsphere aggregation(×1 000)

2.3 超聲輔助制備的空白微球

2.3.1超聲頻率的影響

在恒定的超聲功率(40 W)下，改變超聲頻率，測試了不同頻率作用下制備微球的粒徑分布與形貌特征，結果分別如表1和圖4所示。

表1 超聲頻率對微球粒徑分布的影響Tab.1 Impact of ultrasonic frequency on size distribution of blank microspheres

注：*指測試微球樣品中，具有平均粒徑的體積百分比。

圖4 超聲頻率對微球形貌的影響(×500)Fig.4 Impact of ultrasonic frequency on morphology of microspheres(×500)

由表1可知：隨著超聲頻率的增加，微球平均粒徑明顯減小，與未經超聲波輔助的乳化交聯工藝制備微球相比，在超聲頻率為80 kHz時，微球粒徑幾乎減小至原來的1/5；同時，超聲波輔助下具有平均粒徑的微球體積百分比值逐漸增加，微球粒徑分布標準偏差SD值逐漸減小，2個指標的變化也表明了超聲波輔助還有助于微球粒徑的集中分布，提高粒徑的均勻程度。

由圖4可知，超聲波輔助后制備微球形貌完整，微球間未發生黏連與聚集，且微球粒徑隨著超聲頻率的增加逐漸減小。超聲波輔助工藝下，因聲空化效應，絲素蛋白大分子在乳化交聯體系中被均勻分散，依靠氫鍵和范氏力發生的蛋白大分子集聚現象被打破，分子之間無法產生自聚集和自組裝，因此成球后球壁狀態完整，微球個體穩定。隨著超聲頻率的增加，超聲化效應增強，絲素蛋白的分散傾向于更小且更加均勻[26]，為此隨著超聲頻率的增加，制備微球的粒徑逐漸減少，且粒徑分布更加集中。但在實驗過程中發現，超聲波輔助對微球產率產生較大影響，隨著超聲頻率的增加，制備微球的產率逐漸降低，當頻率達到80 kHz，微球產率已降低至乳化交聯工藝的40%～50%，而當超聲頻率為45 kHz，成球率也有所降低，但降低幅度在10%之內。綜上，實驗選擇在45 kHz條件下，繼續探討超聲功率對微球粒徑分布和形貌的影響規律。

2.3.2超聲功率的影響

在恒定的超聲頻率(45 kHz)條件下，分析了不同功率的超聲波作用對制備微球粒徑分布與形貌特征影響的規律，結果分別如表2、圖5所示。

表2 超聲功率對微球粒徑分布的影響Tab.2 Impact of ultrasonic power size distribution of blank microspheres

圖5 超聲功率對微球形貌的影響Fig.5 Impact of ultrasonic power on morphology of microspheres

由表2可知，隨著超聲波功率的增加，制備微球的平均粒徑也呈逐漸減小的趨勢，但減小幅度不及表1中超聲頻率的影響；與未經超聲波輔助的乳化交聯工藝相比，在45 kHz，100 W條件下制備微球粒徑(4.07 μm)減少至原微球粒徑(15.48 μm)的26%；此外，由微球體積百分比和粒徑分布的SD數據可知，超聲波功率的增加有助于提高微球粒徑分布的均勻性。

由圖5可知，在恒定的超聲波頻率作用下，增加超聲功率將進一步減少微球粒徑，且制備微球未出現集聚和粘連現象。隨著功率的增加，鑲嵌于微球之間小微球或小顆粒有增加的趨勢，這表明隨著超聲波輔助效應的增強，聲空化效應將直接作用于絲素蛋白內部氫鍵及肽鍵，促使絲素蛋白分解成小分子量的蛋白，甚至在乳化過程中形成微小乳滴，難以成球，因此造成微球收率降低。綜上，超聲波輔助乳化交聯工藝可顯著改善微球的團聚現象，促進微球粒徑的均勻分布，但也有降低微球收率的不利影響，在微球制備中尚需對超聲波輔助工藝進行優化設計。

3 結 論

1)尿素脫膠獲得的絲素蛋白具有較高的分子量分布，經乳化交聯工藝制得的絲素蛋白微球平均粒徑為15.08 μm，粒徑標準偏差為0.515；掃描電子顯微鏡觀察發現微球易發生集聚和粘連。

2)超聲波輔助工藝解決了乳化交聯制備微球易于集聚粘連的問題，且制備微球的粒徑隨著超聲頻率、超聲功率的增加而減少，同時微球粒徑分布更加均勻；在45 kHz，100 W的超聲波輔助工藝下制備的微球粒徑減小至原來的26%，粒徑標準偏差同時減小，但超聲波輔助將降低微球的收率。

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