小反芻獸疫病毒四川簡陽株N基因的系統進化分析

張毅，張東，陳斌，蔡冬冬，裴超信，李春

（四川省動物疫病預防控制中心，四川 成都 610041）

本研究對四川省動物疫病預防控制中心保存的2014年簡陽小反芻獸疫病毒（PPRV）陽性鼻拭子進行了PPRV系統進化分析，旨在對四川省2014年發生的PPR疫情進行數據補充。

1 材料

1.1 主要試劑 病毒RNA提取試劑盒，購自北京世紀元亨動物防疫技術有限公司；PrimeScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2（Dye Plus）試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司。

1.2 PPRV陽性材料 2014年從四川簡陽地區采集羊鼻拭子1份，經熒光RT-PCR確定為PPRV陽性，由四川省動物疫病預防控制中心實驗室于-80℃保存。

1.3 引物 參照文獻[1]合成引物，用于N基因擴增。目的片段預期長度為1845bp，擴增引物NF：5'-ACCAAACAAAGTTGGGTAAGGA-3'，N-R：5'-CAGCCCCTTGTTGACATGGTAT-3'。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

2 方法

2.1 PPRV SCJY株N基因的擴增和序列測定

2.1.1 核酸提取 將鼻拭子以9 100 r/min離心2min，取上清液，按照病毒RNA提取試劑盒說明書提取病毒RNA，-20℃保存待用。

2.1.2 RT-PCR擴增和序列測定 取5 μL病毒RNA，按RT-PCR試劑盒說明書配制50 μL反應體系，按以下程序進行擴增：50℃ 30min，94℃ 5 min；94℃ 30s，53℃ 30s，72℃ 90s，循環 35 次；72℃延伸5min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳確認后，送生工生物工程（上海）有限公司克隆、測序。

2.2 PPRV基因組序列分析 從GenBank獲取PPRV代表毒株N基因序列15條，通過DNASTAR軟件，采用Clustal W方法進行N基因核苷酸比對和氨基酸比對；通過MEGA6軟件，采用Neighbor-Joining法構建N基因進化樹，Bootstrap值為1000。

3 結果

3.1 PPRV SCJY株N基因的擴增及測序結果 PCR產物瓊脂糖凝膠電泳結果顯示：擴增出約1.8kb條帶，與目的片段大小相同（圖1）。擴增產物克隆測序成功，序列全長1845bp。

3.2 PPRV SCJY株N基因的同源性分析結果 將SCJY株與15條參考序列進行比對分析，參考序列信息見表1。16株PPRV N基因的長度均為1578nt。同源性分析結果（圖2）表明，16個PPRV毒株N基因的核苷酸同源性介于88.8%～100%之間，其中SCJY株與新疆株XJYL2013的同源性最高（100%），與烏干達株Uganda 2012的同源性最低（88.9%），與疫苗株Nigeria75/1的同源性為93.6%；N蛋白氨基酸比對結果（圖3）表明，16個PPRV毒株N蛋白的同源性介于92.8%～100%之間，其中SCJY株與新疆株XJYL2013、河南株CH/HNNY/2014的同源性最高（100%），與烏干達株Uganda 2012、阿聯酋株UAE 1986的同源性最低（92.8%），與疫苗株Nigeria75/1的同源性為94.9%。

圖1 SCJY株N基因擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

表1 SCJY株及參考毒株的信息表

3.3 PPRV SCJY株N基因的系統進化分析結果 SCJY株與參考株的N基因核苷酸Neighbor-Joining進化樹見圖4。如圖所示，16株PPRV的N基因形成了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個譜系：塞內加爾E32株構成Ⅰ系，尼日利亞疫苗株Nigeria/75/1和加納株Ghana/NK1/2010構成Ⅱ系；阿聯酋株UAE 1986、埃塞俄比亞株Ethiopia 1994、蘇丹株MIELIK_72、烏干達株Uganda 2012構成Ⅲ系；SCJY株和其他4個中國株（河南、新疆、北京、西藏）的遺傳距離最近，這5個中國株與土耳其株、摩洛哥株、2個印度株構成Ⅳ系。

圖2 16株PPRV N基因的核苷酸同源率

圖3 16株PPRV N蛋白的氨基酸同源率

圖4 16株PPRV N基因系統進化樹

4 討論

根據N基因序列，世界范圍內的PPRV毒株可以分為4個譜系[1]，各型具有明顯的地域特征，Ⅰ系主要是西非（科特迪瓦、塞內加爾和幾內亞）毒株，Ⅱ系主要是加納、尼日利亞和馬里毒株，Ⅲ系主要是東非（埃塞俄比亞和蘇丹）和阿拉伯半島南部（阿曼和阿聯酋）毒株，Ⅳ系主要是亞洲毒株，包括中國、土耳其、以色列、沙特阿拉伯和印度等，本研究的分型結果與文獻報道類似。本研究中的SCJY株屬于Ⅳ系，其N基因與新疆株的同源性達到100%，與同時期國內流行毒株的同源性也在99%以上，表明SCJY株與2013～2014年我國發生的PPRV主要毒株相同，該毒株進入國境后迅速傳播到不同地區，尚未在各地區開始基因組演化。

目前，尼日利亞株Nigeria/75/1是OIE唯一允許使用的疫苗株，臨床免疫保護效果好[2-3]，免疫保護期長，能滿足現階段預防PPR的需求。然而，Nigeria/75/1是弱毒疫苗，在進化關系上又與我國流行株分屬不同的基因型，在疫苗免疫壓力下，本地毒株會不會發生突變、重組等演化，從而導致新毒株產生，進而引起免疫失敗？是特別需要關注的問題。因此，臨床上除對疫苗免疫抗體實施定期監測[4-5]外，還需加強對PPRV病原的監測力度，進一步開展病毒攜帶率、發病病例的分子生物學分析等研究。