芪?？诜嘿|量標準提高研究

鐘文雨 ，于士龍 ，汪 宇

（1.沈陽藥科大學，遼寧 沈陽 110042； 2.中國人民解放軍北部戰區空軍醫院，遼寧 沈陽 110042）

芪?？诜涸谥袊嗣窠夥跑姳辈繎饏^空軍醫院臨床應用已近10年，療效確切，主要用于治療皮膚瘙癢、慢性蕁麻疹、神經性皮炎、鼻炎、哮喘等癥，為該院治療過敏性鼻炎的主要用藥。該制劑主要由黃芪、黃芩、陳皮、麻黃、當歸、細辛、桑葚等14味中藥組方，其現行標準僅對黃芩進行了定性鑒別，未對其主要成分進行含量測定。為進一步控制該制劑的質量，保證臨床用藥安全有效，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對黃芪、陳皮、麻黃進行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測定黃芩苷含量。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，包括二極管陣列檢測器，Chemstation工作站（美國 Agilent公司）；MS105DU型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）；JA5003型電子分析天平（上海舜宇恒平科學儀器有限公司）；KQ3200DB型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試藥

芪?？诜海ㄖ袊嗣窠夥跑姳辈繎饏^空軍醫院，批號分別為 20151012，20151116，20151207，規格為每支 10 mL）；黃芩苷對照品（批號為 110715-201318，純度為 98.5%），黃芪對照藥材（批號為 121054-201115），陳皮對照藥材（批號為 120908-201216），麻黃對照藥材（批號為120915-201214），均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、磷酸為色譜純，其他試劑均為分析純，水為重蒸水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

黃芪[1-2]：取樣品 80 mL，加熱濃縮至 10 mL，加水10 mL，用水飽和正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，取上層液，分別用1%氫氧化鈉溶液和正丁醇飽和水溶液各洗滌3次，每次20 mL，棄去洗滌液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙秉S芪的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按2015年版《中國藥典（四部）》通則0502 TLC法(以下簡稱“藥典TLC法”)試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以二氯甲烷 -甲醇 -水（13∶5∶2，V／V／V）10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105℃加熱至斑點顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 A。

陳皮[3-4]：取樣品20 mL，用乙酸乙酯振搖提取3次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取陳皮對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙标惼さ年幮詷悠?，同法制成陰性對照品溶液。按“藥典TLC法”試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯 -乙酸乙酯（3∶2，V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，用同一展開劑二次展開，取出，晾干。置紫外光（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 B。

麻黃[5-6]：取樣品 40 mL，加熱濃縮至 10 mL，加水10 mL，再加濃氨試液2 mL，用二氯甲烷振搖提取2次，每次30 mL，合并二氯甲烷液，蒸干，殘渣加甲醇1 mL使溶解，作為供試品溶液。另取麻黃對照藥材2 g，加水20 mL，煎煮1 h，濾過，濾液同法制成對照藥材溶液。按芪?？诜禾幏胶凸に囍苽淙甭辄S的陰性樣品，同法制成陰性對照品溶液。按“藥典TLC法”試驗，吸取上述3種溶液各10 μL，分別點于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯 -丁酮 -甲酸 -水（5∶3∶0.5∶0.5，V／V／V／V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵溶液，日光燈下檢視。結果供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。詳見圖1 C。

2.2 黃芩苷含量測定

2.2.1 色譜條件[7-9]

色譜柱：Diamonsil C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）；流速：1.0 mL ／min；檢測波長：280 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

對照品溶液：取黃芩苷對照品約25 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加50%甲醇溶解并定容，搖勻，即得。

供試品溶液：取樣品20 mL，離心，精密量取上清液1 mL置50 mL容量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容，搖勻，濾過，取續濾液，即得。

陰性對照品溶液：按芪桑口服液處方和工藝制備缺黃芩的陰性樣品，同法制備陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：取2.2.2項下各溶液適量，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄色譜圖(見圖2)。結果陰性對照品溶液在與黃芩苷對照品溶液相同保留時間處無干擾峰，表明專屬性良好。

線性關系考察：稱取黃芩苷對照品適量，精密稱定，加50%甲醇制成黃芩苷質量濃度為200 μg／mL的對照品貯備液。分別精密量取上述貯備液并加50%甲醇稀釋，制成質量濃度為 10，20，50，100，200 μg ／mL 的系列對照品溶液，各吸取20 μL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芩苷質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y＝82.965 X-414.53，R2＝0.999 8(n＝5)。結果表明，黃芩苷質量濃度在10～200 μg／mL范圍內與峰面積線性關系良好。

精密度試驗：取 2.2.2 項下對照品溶液 20 μL，按擬訂色譜條件連續進樣測定6次，記錄峰面積。結果的RSD為0.08%（n＝6），表明儀器精密度良好。

圖1 薄層色譜圖

圖2 高效液相色譜圖

穩定性試驗：取2.2.2項下供試品溶液適量，分別于室溫下放置 0，2，6，12，24 h時按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果的 RSD為0.39%（n＝5）；表明供試品溶液在室溫放置24 h內基本穩定。

加樣回收試驗：取已知含量（40.18 μg ／mL）的樣品1.5 mL，共 6 份，分別加入黃芩苷對照品溶液（50 μg ／mL）1 mL，加50%甲醇定容至10 mL，按擬訂色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算回收率。結果見表1。

表1 加樣回收試驗結果（n＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3批樣品各適量，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣，平行測定3次，記錄峰面積并計算樣品含量。結果批號為 20151012，20151116，20151207的樣品中黃芩苷含量分別為 2.009，2.016，2.014 mg ／mL。結合藥材來源，以及藥品生產、貯藏等因素，暫定每毫升樣品含黃芩苷不得少于2.009 mg。

3 討論

本制劑原質量標準較簡單，僅有黃芩的定性鑒別，不僅鑒別數量過少，且未做包含陰性對照的方法學驗證試驗。本研究中參考相關文獻和大量試驗研究對原TLC法進行了驗證和修訂，解決了陰性干擾問題，并保證了試驗的重復性。此外，研究中還另建立了陳皮的TLC法，其重復性及專屬性均較好。

黃芩是芪桑口服液的君藥之一，且處方量最大，具有較好的免疫抑制作用，尤其對Ⅰ型變態反應作用顯著。黃芩的這種抗炎、抗過敏作用與芪?？诜旱目惯^敏、抗支氣管痙攣和抗組胺等功能主治一致。故本研究中選擇黃芩苷作為芪桑口服液的定量指標。

預試驗中對流動相體系進行了考察，分別采用了甲醇 -0.4% 磷酸溶液（28 ∶72，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（40∶60，V／V）、甲醇 -0.4%磷酸溶液（47 ∶53，V／V）、甲醇 -0.4% 磷酸溶液（60 ∶40，V／V），結果發現，以甲醇 -0.4% 磷酸溶液（47 ∶53，V／V）為流動相時峰形和分離度均良好，故本研究中以此為流動相。

綜上所述，本研究中建立的方法操作簡便，專屬性強，精密度、穩定性、重復性均較好，可用于芪?？诜旱馁|量控制。