表面活性劑-超聲協同提取紅景天總黃酮工藝優選

洪松彬 ，何石蘭 ，黃海潮 ，聶 陽

（1.廣州中醫藥大學第一附屬醫院，廣東 廣州 510405； 2.廣東省中醫院二沙島分院，廣東 廣州 510105；3.廣東食品藥品職業學院，廣東 廣州 510520）

紅 景 天 Rhodiola crenulata（Hook.f.et Thoms.） H.Ohba為薔薇目景天科多年生植物，其根莖粗壯且略帶芳香，是主要入藥部位[1]，具有扶正固本、理氣養血的功效，主治氣虛血瘀、氣短乏力、倦怠氣喘等氣虛證。現代藥理學研究表明，其具有改善心肺功能、促進血管生長、保護缺氧心肌、改善急性腦梗死狀態等作用[2-4]。黃酮類化合物是紅景天中主要活性成分之一，包括山柰酚、草質素苷、槲皮素、花色苷等[5]。黃酮類化合物一般以水溶性苷或脂溶性苷元2種形式存在，由于苷與苷元的極性相差較大，傳統提取方法如水煎煮法、回流法、酶解法、超聲法和微波法均難以同時提高兩類成分的提取率[6]。表面活性劑提取是近年興起的中藥提取法，利用其增溶作用，可增加藥材中苷元等脂溶性成分的溶解度，從而大大提高低極性成分的提取率[7]。本試驗中采用表面活性劑-超聲協同提取法，通過正交試驗優選紅景天總黃酮的提取工藝參數，為在工業化生產中引進高效、經濟的中藥提取方法提供參考。

1 儀器與試藥

儀器：UV-1800型紫外分光光度計（日本島津公司）；SB-5200DTD型超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；D101型大孔樹脂（天津波鴻樹脂科技有限公司）。

試藥：蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為100080-201708，純度≥99%）；紅景天飲片（廣東康美藥業股份有限公司，批號為180120361）；試驗所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 藥材處理流程及提取方法

紅景天清洗→干燥→粉碎→過80目篩→密封保存→稱取適量紅景天粉末（5 g）→加入乙醇和1.0%十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液→超聲提取→回收溶劑濃縮粗提物→抽濾去除藥材碎渣→大孔樹脂柱純化→微孔濾膜濾過不溶性顆粒→取上清液（即為供試品溶液）→檢測。

2.2 紅景天總黃酮的相關測定

測定波長選擇：以蘆丁為對照品，采用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH法測定總黃酮含量。稱取蘆丁對照品10.80 mg，精密稱定，以70%乙醇溶解并定容至50 mL，搖勻，得質量濃度為0.216 g／L的對照品溶液。分別吸取對照品溶液和2.1項下供試品溶液適量，各置25 mL容量瓶中，加入5%NaNO2溶液1.0 mL，搖勻，放置6 min，加 10%Al（NO3）3溶液 1.0 mL，搖勻，放置 6 min，加入4%NaOH溶液 10.0 mL，用70%乙醇定容，搖勻，放置15 min。以70%乙醇為參比液，在300～700 nm波長區間掃描。結果對照品溶液和供試品溶液在510 nm波長處均有最大吸收，故選取510 nm為測定波長。

提取率計算：準確量取蘆丁對照品溶液 0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL，分別置 25 mL 容量瓶中，于510 nm 波長處測定吸光度。以質量濃度（X，μg／mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程 Y＝0.012 4 X＋0.003 57，r＝0.999 4(n＝7)。結果表明，蘆丁質量濃度在 5.417 ～55.282 μg／mL 范圍內與吸光度線性關系良好。精密度和24 h穩定性試驗結果的 RSD 分別為 1.10% 和 0.92% （n＝6）；加樣回收率為 98.58% ，RSD ＝1.50%(n＝6）。取供試品溶液適量，依法操作，測定510 nm波長處吸光度，計算總黃酮質量濃度，并按公式計算提取率。提取率（%）＝[K×cx× V／（106× m）]×100% ，式中，K 為稀釋倍數，cx為供試品溶液中總黃酮質量濃度（μg／mL），V為供試品溶液體積（mL），m 為紅景天飲片質量（g）。

2.3 表面活性劑篩選

稱取6份藥材樣品粗粉各5.00 g，置燒瓶中，加10倍量70%乙醇，分別加入體積分數為1.0%的不同親水疏水平衡值（HLB）的表面活性劑，超聲（功率為500 W）提取1 h，濾過后得供試品溶液。按2.2項下方法測定吸光度，計算總黃酮提取率，結果見表1。陰離子表面活性劑的加入可顯著提高總黃酮的提取率，其中以SDS效果最好，可能是SDS形成的膠束更有利于黃酮的增溶[8]。故選用SDS作為表面活性劑。

2.4 單因素試驗

稱取6份藥材樣品粉末各5.00 g，試驗條件為按料液比1∶10(g∶L)加入70%乙醇作為溶劑，加入SDS至終體積分數為1%，超聲提取15 min。

SDS濃度選擇：分別加入SDS至終體積分數依次為0.5% ，1.0% ，1.5% ，2.0% ，2.5% ，3.0% ，平行提取 3次，按2.2項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率，結果見圖1。可見，隨著SDS體積分數的增加，總黃酮提取率也逐漸升高，在SDS體積分數為1.5% 時，總黃酮提取率最大，再增加SDS體積分數，總黃酮提取率不再升高，故SDS的體積分數應在1% ～2%范圍進行優化。

超聲功率篩選：將超聲功率分別設為 300，400，500，600，700，800 W，平行提取 3 次。按 2.2 項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率，結果見圖2。可見，超聲功率在300～600 W范圍內總黃酮提取率逐漸升高，當功率超過700 W后，總黃酮提取率顯著降低。其原因為超聲功率過大時，高頻振動產生的熱效應使溫度升高，導致熱穩定性較差的黃酮類成分含量減少，故應在500～700 W范圍內對超聲功率進行優化。

提取時間篩選：分別超聲提取 5，10，15，20，25，30 min，平行提取3次，按2.2項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率，結果見圖3。可見，隨超聲時間的延長，總黃酮提取率逐漸升高，在15～20 min時總黃酮提取率最高，繼續延長時間，總黃酮提取率反而降低。這可能是因超聲波具有較強的熱效應，過長時間作用會破壞黃酮類成分，故應在15～25 min范圍內對提取時間進行優化。

表1 表面活性劑種類對總黃酮提取率的影響

圖1 SDS體積分數對總黃酮提取率的影響

圖2 超聲功率對總黃酮提取率的影響

圖3 超聲時間對總黃酮提取率的影響

乙醇體積分數篩選：分別以體積分數為40%，50%，60%，70%，80%，90%的乙醇作為溶劑進行提取，平行提取3次，按2.2項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率，結果見圖4。可見，隨著乙醇體積分數的增加，總黃酮提取率逐漸升高，當乙醇體積分數為60%時總黃酮提取效率最高，而乙醇體積分數大于70%時總黃酮提取率開始下降。這是因黃酮大多以苷的形式存在于藥材中，其水溶性較好，當乙醇和水達到適合的比例時，糖苷與苷元兩者均能更好地溶劑化，若乙醇體積分數過高則不利于黃酮苷類成分的溶解。此外，從實際生產成本方面考慮，需節約乙醇的用量，故乙醇體積分數應在40%～60%范圍內進行優化。

圖4 乙醇體積分數對總黃酮提取率的影響

料液比篩選：分別按料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1 ∶20、1 ∶25、1 ∶30(g∶L)的比例加入溶劑進行提取，平行提取3次，按2.2項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率，結果見圖5。可見，溶劑比例逐漸增大，總黃酮的提取率逐漸升高，但當料液比超過1∶15(g∶L)后，再增加溶劑的用量時總黃酮提取率并無明顯提高，反而延長了溶劑回收、產物濃縮干燥等后續步驟的耗時，故對料液比應在 1∶10～1∶20(g∶L)范圍內進行優化。

圖5 料液比對總黃酮提取率的影響

2.5 正交試驗

直觀分析和極差分析：根據單因素試驗，對提取總黃酮所需的SDS體積分數（A）、超聲功率（B）、提取時間（C）、乙醇體積分數（D）、料液比（E）5 個因素進行 3 水平的正交試驗 L27（35）分析。結果見表2和表3。得出的最佳提取條件為 A2B2C1D3E1，即 SDS終體積分數為1.5%，超聲功率為 600 W，提取15 min，乙醇體積分數為60%，料液比為1∶15(g∶L)。極差分析結果顯示，各因素對總黃酮提取率的影響強度依次為A＞B＞D＞E＞C。

表2 正交試驗因素水平表

表3 L27(35)正交試驗設計與結果

方差分析：為了區分因素水平和試驗誤差引起的數據波動，需在直觀分析和極差分析基礎上進行方差分析[9]。計算各因素的平均方差，其中因素C平均方差值最小，故將因素C選為誤差項。方差分析結果表明，A，B，D 3個因素對總黃酮提取率的影響差異均有統計學意義（P＜0.05），而C和E兩因素對總黃酮提取率的影響差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見表4。

表4 方差分析結果

2.6 驗證試驗

稱取 5份藥材樣品，每份各 5.00 g，按 2.5項下最佳提取條件進行操作，按2.2項下方法測定總黃酮含量并計算其提取率。結果提取率分別為4.03%，4.02%，4.05% ，4.03% ，4.06% ，平均 4.04% ，RSD 為 0.81%(n＝5)，表明優化的提取工藝穩定可靠，提取率較高。

3 討論

L27（35）正交試驗分析結果表明，表面活性劑體積分數、超聲功率和乙醇體積分數為顯著影響總黃酮提取率的主要因素。在表面活性劑的選擇上，本試驗中分別考察了離子型和非離子型2種HLB值大于13.0的表面活性劑對總黃酮提取率的影響。可見，使用離子型表面活性劑的提取率明顯高于非離子型表面活性劑。黃酮類化合物結構上含有多個酚羥基而帶有酸性，在一定pH范圍內帶電，因此可通過靜電力與帶有電荷的離子型表面活性相互親合，從而加強SDS等表面活性劑的增溶作用，提高總黃酮提取率[10]。表面活性劑可通過形成膠束結構來增加溶質的水溶性，臨界膠束濃度（CMC）是衡量表面活性劑增溶能力的關鍵指標，溶劑中CMC值越小，增溶能力越強。由表面活性劑的篩選結果可推測，在60% 乙醇中，SDS的CMC值最小。單因素試驗結果表明，當SDS體積分數達2.0%后，即使繼續增加，總黃酮的提取率也不再增加，這是由于SDS體積分數超過CMC后，繼續增加SDS的劑量，形成膠束數量并未隨之增加，故未能提高總黃酮提取率。此外，過多使用SDS，可導致藥材中其他成分的溶解度增加，從而引入其他雜質。

超聲提取法是目前廣泛用于中藥成分提取的方法之一，利用超聲波的高頻機械振蕩作用使溶劑快速進入植物細胞中，同時通過空化效應瞬間將植物組織和細胞分解、破裂，使細胞的內容物釋放與溶出，且超聲波具有熱效應，可增大細胞內溶質的溶解度或擴散速率，3種作用機制相互配合發揮作用，可大大提高中藥成分的提取率[11]。本試驗結果表明，超聲功率是影響黃酮提取率的次要因素，超聲功率的設定必須適中，功率偏低，提取率不高，而功率過高，產生的熱效應過大，會導致穩定性較差的黃酮類成分氧化或分解[12]，正交試驗分析顯示功率設為600 W為最佳。

黃酮類化合物的提取主要以乙醇為溶劑，90%～95%乙醇適用于苷元的提取，60%乙醇適用于黃酮苷的提取，將優化工藝的驗證結果和乙醇體積分數單因素提取結果進行對比分析，可見在同樣以60%乙醇作為提取溶劑的條件下，前者的提取率明顯高于后者，原因是適量的SDS作為增溶劑能有效增加黃酮苷元在60%乙醇中的溶解度，從而顯著提高總黃酮提取率，同時也可減少乙醇的用量，降低生產成本。

超聲提取時間和料液比在5個因素中對總黃酮提取率的影響較小，但兩提取因素的設定仍值得注意，提取時間過長，超聲熱效應可產生過多的熱量，會導致黃酮分子中具有還原性的酚羥基發生氧化[13]；溶劑用量過多，會增加溶劑回收、提取物濃縮、產物干燥等后續步驟的時間消耗，導致生產效率降低，成本耗費增加。綜合本試驗各方面數據分析，利用表面活性劑-超聲協同提取紅景天總黃酮，按料液比1∶15(g∶L)加入60%乙醇作為溶劑，以終體積分數1.5%的SDS為增溶劑，超聲（功率設為600 W）提取15 min，可獲得滿意的總黃酮提取率。