miR-27a和miR-378在中外豬種背最長肌中的差異表達研究

楊雪梅，顧以韌，梁 艷，陶 璇，楊躍奎，曾 凱，陳曉暉，鐘志君，呂學斌（四川省畜牧科學研究院，動物遺傳育種四川省重點實驗室，四川 成都 610066）

miRNA是一類內生的、長度約為20～22個核苷酸，其在基因表達調控、脂肪細胞分化、脂質代謝等生理過程中均發揮著重要的作用[1-3]。miR-27是迄今發現與人類脂肪細胞分化相關性最強的miRNA之一，其過表達能夠降低LPL基因的表達量，進而抑制甘油三酯的積累以及脂肪生成基因的表達；miR-378與脂肪分化密切相關，其在小鼠3T3-L1前體脂肪細胞分化成熟后表達量明顯上調[4-5]，miR-378還可通過影響雄烯酮和糞臭素代謝而對公豬的膻味起調控作用進而影響豬肉質[6]。鑒于這兩種miRNA與豬肉品質調控存在的關系，研究于2017年采用Q-PCR技術對四川省3個地方豬種和約克夏背最長肌組織中miR-27a和miR-378的表達與肉質性狀的差異進行了研究。該研究為培育優質高效的新品種/配套系提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及樣本采集

試驗豬只均由四川省畜牧科學研究院種豬科研基地提供。每個豬種隨機選取6頭，共計24頭，所有試驗豬只于同一時間開始組建群體，30日齡斷奶，采用相同營養水平和飼喂方式，達到9月齡時進行屠宰，屠宰前停食24 h，自由飲水。屠宰后迅速采集倒數3～4肋骨間對應處的背最長肌組織，用于后續的肉質相關表型指標測定和miRNA熒光定量檢測。

1.2 肌內脂肪含量（IMF）測定

采用瑞士步琪（BUCHI）全自動快速抽提儀進行抽提，程序設置為萃取2 h，淋洗5 min，干燥20 min，每個樣本獨立測定兩次。樣品處理和試驗操作嚴格按照國標GB/T 9695.1—2008《肉與肉制品游離脂肪含量測定》進行。

1.3 肌纖維直徑測定

采用KD-2508型切片機（Kedee,China）制作背最長肌樣本的冰凍切片，H.E染色后用顯微成像系統（Optec,China）采集代表性區域圖像，通過Motic Images Advanced 3.2顯微圖像分析軟件測定每個樣品的肌纖維面積。

1.4 硫胺素含量測定

樣本處理和試驗方法參照國家標準GB/T 5009.84—2003《食品中硫胺素（維生素B1）的測定》。

1.5 眼肌面積和瘦肉率測定

測量左胴體倒數3～4肋眼肌的寬、高，按照寬×高×0.7計算眼肌面積。按豬胴體性狀測定技術規范（NY/T 825—2004）方法測定并計算瘦肉率。

1.6 miR-27a和miR-378含量的測定

引物信息見表1。所有目的miRNA定量結果均通過溶解曲線分析驗證PCR產物的特異性，確保產物無引物二聚體，每個樣本重復3次，每次檢測含3個陰性對照。采用2-ΔΔCt法計算目的miRNA的相對表達量。

表1 引物信息

1.7 統計方法

試驗數據采用Sigmaplot 12.0對性狀指標和基因表達量進行ANOVA分析，相關性采用Pearson Correlation程序分析。

2 結果與分析

2.1 相關肉質指標含量

由表2可知，在4個豬種中，雅南豬肌內脂肪含量最高（5.07%），其次為內江豬（4.67%），約克夏豬最低（2.15%），雅南豬、內江豬、成華豬極顯著高于約克夏豬（P＜0.01），雅南豬和內江豬顯著高于成華豬（P＜0.05）。成華豬肌纖維直徑最小（73.18 μm），約克夏肌纖維直徑最大（92.36 μm），約克夏豬肌纖維直徑極顯著高于3個地方豬種（P＜0.01），3個地方豬種間差異不顯著。3個地方豬種的眼肌面積在16～22 cm2之間，約克夏豬眼肌面積達 35.28 cm2，約克夏豬極顯著高于3個地方豬種（P＜0.01），3個地方豬種間差異不顯著。3個地方豬種的瘦肉率差異不顯著，均在43%～45%之間，約克夏豬的瘦肉率最高，為62.32%，極顯著高于3個地方豬種（P＜0.01）。雅南豬的硫胺素含量最高，為2.79 μg/g，其次是成華豬（1.84 μg/g），內江豬硫胺素含量最低，為 1.11 μg/g，其次為約克夏豬，為1.20 μg/g，雅南豬顯著高于內江豬和約克夏豬（P＜0.05），和成華豬無顯著差異，成華豬、內江豬豬和約克夏豬之間無顯著差異。

表2 不同豬種相關肉質指標含量（n=6）

2.2 2種miRNA的表達水平

采用Q-PCR的方法，檢測了miR-27a和miR-378在豬背最長肌中的相對表達量，其結果見表3。由表3可知，內江豬的miR-27a的相對表達量最高，其次為約克夏豬，最低的為雅南豬，內江豬的miR-27a的相對表達量顯著高于其它3個豬種（P＜0.05），成華豬、雅南豬和約克夏豬之間差異不顯著。內江豬miR-378相對表達量最高，其次為成華豬，最低的為雅南豬，成華豬和內江豬極顯著高于雅南豬和約克夏豬（P＜0.01），成華豬顯著低于內江豬（P＜0.05）。

表3 不同豬種的miR-27a、miR-378含量（n=6）

2.3 2種miRNA的表達水平與肉質相關指標含量的相關性

采用Sigmaplot 12.0分析了肉質性狀相關指標和基因表達量的相關性，由表4可知，miR-27a、miR-378在背最長肌中的表達水平與肌內脂肪含量和硫胺素含量呈正相關（r肌內脂肪含量=0.6～0.71；r硫胺素=0.1～0.3）；miR-27a、miR-378 在背最長肌中的表達水平與肌纖維直徑、眼肌面積、瘦肉率呈負相關（r肌纖維直徑=-0.1～-0.3；r眼肌面積=-0.3～-0.4；r瘦肉率=-0.7～-0.8）。

表4 miR-27a、miR-378與肉質相關指標的相關性分析（n=6）

3 討論

影響豬肉質風味的因素很多，其中肌內脂肪含量是重要決定因素之一，其與肉的多汁性、嫩度和風味密切相關，肌肉中的脂肪越多，則肉的多汁性越好，在4個豬種中，3個地方豬種的肌內脂肪含量在3.76%～5.07%之間，肉質優良，約克夏豬的肌內脂肪含量2.15%，極顯著低于3個地方豬種；肌纖維直徑越細，肉質就越細嫩，研究顯示3個地方豬種的肌纖維直徑在70～80 μm之間，肉質細嫩，約克夏豬肌纖維直徑為92.36 μm，極顯著高于3個地方豬種；胴體瘦肉率是評價胴體品質的主要指標，3個地方豬種的胴體瘦肉率在43%～45%之間，約克夏豬達62.32%，極顯著高于地方豬種；硫胺素是一種非常重要的風味前體物質，其熱降解是食品加工過程中風味形成的主要途徑之一[7]，研究顯示成華豬和雅南豬肌肉中的硫胺素含量較高。由本研究可知，地方豬種較外種豬肉質優良，風味佳、口感好，但瘦肉率較低，可作為豬種培育的育種素材。

miRNA對豬肌肉發育有著重要的調節作用[8]。本研究采用熒光定量PCR技術對成華豬、雅南豬、內江豬和約克夏豬背最長肌組織中miR-27a和miR-378差異表達進行了研究。結果顯示背最長肌組織中2個miRNA的表達水平在4個豬種中趨于一致。相關性分析顯示，2種miRNA在背最長肌中的表達水平與肌內脂肪含量和硫胺素含量呈正相關，與肌纖維直徑、眼肌面積和瘦肉率呈負相關，表明miR-27a和miR-378對豬肉質具有正調控作用，而對豬胴體性能具有負調控作用，其可以影響豬肌肉生長和脂肪沉積，為通過調控其表達水平實現對豬肉質風味的改善提供了可能。