塵肺患者外周血miR-21表達與細胞因子分泌、膠原代謝及氧化應激的相關性

董明霞, 龐波, 李茜, 李娟，劉麗

肺塵埃沉著病簡稱塵肺，是由長期吸入生產性粉塵引起的職業病，以肺間質彌漫性纖維化為主要病理特征[1-2]。當塵肺患者出現肺纖維化時，局部組織的病理改變難以逆轉，患者的肺功能會呈現出進行性減退的趨勢并造成生活質量下降，臨床治療難度大。在生產性粉塵吸入并在肺內潴留后，粉塵能夠刺激局部組織起炎性反應、氧化應激反應激活并造成組織損傷，在組織損傷的修復過程中多種細胞因子的大量分泌能夠造成膠原異常沉積并逐步形成纖維化。目前，細胞因子分泌、膠原代謝、氧化應激異常等病理環節與塵肺病情發展變化的關系受到越來越多關注[3-4]，但調控上述病理環節的機制尚未明確。微小RNA(micro RNA)是近年來新發現的非編碼RNA，能夠通過調節多種基因的表達來產生相應的生物學效應，其中miR-21是已知在塵肺病程中發揮明顯改變的miRNA[5]。為了明確miR-21表達改變與塵肺病程中病理環節的關系，現分析塵肺患者外周血miR-21表達與細胞因子分泌、膠原代謝、氧化應激的相關性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月—2018年2月四川省攀枝花市第二人民醫院職業病科診治塵肺患者43例作為塵肺組， 男29例，女14例，年齡49～63 (56.41±7.93)歲，病程3～11 (6.51±0.71)年；塵肺I期18例，II期16例，III期9例;合并高血壓11例、糖尿病8例，有哮喘家族史6例；另取同期在我院進行健康體檢的志愿者60例作為對照組，男38例，女22例，年齡45～60(54.85±7.34)歲;合并高血壓14例，糖尿病12例，有哮喘家族史9例。2組患者一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2 選擇標準 納入標準 ：(1)符合塵肺病診斷標準[6]；(2)首次診斷且未接受過對癥治療；(3)取得患者及家屬知情同意。排除標準：(1)合并肺內惡性腫瘤、肺結核、肺部感染急性期的患者；(2)合并自身免疫性疾病、內分泌系統疾病的患者；(3)肝腎功能不全的患者。

1.3 觀測指標與方法 入組后，于晨起空腹采集2組人員空腹肘靜脈血8 ml 待用。

1.3.1 miR-21表達量測定： 上述靜脈血2 ml，采用miRNA提取試劑盒分離miRNA， miRNA cDNA第一鏈合成試劑盒將外周血中的miRNA反轉錄為cDNA， miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒對目的基因miR-21及內參基因U6進行擴增，按照miR-21/U6計算miR-21的表達量。試劑盒由康為世紀公司提供。

1.3.2 血清指標測定： 上述靜脈血6 ml，離心分離血清采用酶聯免疫吸附法測定。(1)細胞因子：轉化生長因子-β1(TGF-β1)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、結締組織生長因子(CTGF)；(2)血清膠原代謝指標：基質金屬蛋白酶(MMP-9)、纖溶酶原激活物(uPA)、膠原蛋白-I(Col-I)、膠原蛋白-III(Col-III)；(3)氧化應激指標：8-異前列腺素 F2α(8-iso-PGF2α)、一氧化氮(NO)、總抗氧化力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(SOD)的含量。試劑盒由上海西唐公司提供。

2 結 果

2.1 miR-21表達量比較 外周血miR-21的表達量塵肺組為1.88±0.25，高于對照組的1.04±0.18 (t=19.837，P=0.000)。

2.2 血清細胞因子比較 塵肺組血清TGF-β1、TNF-α、CTGF含量明顯高于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 2組血清細胞因子含量比較

2.3 血清膠原代謝指標比較 塵肺組血清MMP-9、uPA、Col-I、Col-III含量高于對照組(P<0.05)，見表2。

2.4 血清氧化應激指標比較 與對照組比較，塵肺組血清8-iso-PGF2α、NO含量明顯升高，T-AOC、SOD的含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

2.5 相關性分析 外周血miR-21表達量與血清TGF-β1、TNF-α、CTGF、MMP9、uPA、Col-I、Col-III、8-iso-PGF2α、NO含量呈正相關(r/P=0.652/0.004、0.474/0.024、0.512/0.018、0.423/0.029、0.559/0.020、0.609/0.009、0.541/0.014、0.629/0.008、0.635/0.006)；與血清T-AOC、SOD含量呈負相關(r/P=-0.577/0.013、-0.519/0.019)。

表2 2組血清膠原代謝指標比較

表3 2組血清中氧化應激指標的比較

3 討 論

塵肺是我國發病率最高的職業病之一，長期吸入生產性粉塵是疾病的直接病因，而粉塵在肺內潴留所引起的肺纖維化則是疾病的病理特征。塵肺的發病機制未明，增加了臨床治療的難度。miR-21是近年來新發現的與多種組織纖維化密切相關的miR。本研究的分析顯示：塵肺組患者外周血中miR-21的表達量明顯高于對照組。關于miR-21多項動物實驗報道，miR-21對肺臟、腎臟、心臟組織的纖維化均具有促進作用，調控炎性反應、膠原代謝、氧化應激，是miR-21在實驗動物體內發揮促纖維化作用的分子途徑[7-9]。本結果提示：miR-21的高表達與塵肺的發生發展有關，高表達的miR-21能夠通過促進肺纖維化來參與塵肺的發生發展。

粉塵在肺內潴留能夠刺激TGF-β1、TNF-α、CTGF等多種細胞因子在局部組織內大量分泌，進而通過細胞因子各自的生物學活性來促進組織發生纖維化。本研究的分析顯示：塵肺組患者血清TGF-β1、TNF-α、CTGF的含量明顯高于對照組，且與血清細胞因子的含量與外周血中miR-21的表達量呈正相關。TGF-β1是目前已知促纖維化作用最顯著的細胞因子，一方面能夠參與成纖維細胞的活化并促進纖維結締組織增生；另一方面能夠促進膠原蛋白、黏連蛋白相互結合并在細胞外基質內大量沉積，兩方面因素共同作用，能夠加重組織纖維化[10]；TNF-α是具有促炎活性的細胞因子，粉塵刺激TNF-α分泌后能夠在局部招募多種炎性細胞，進而通過炎性細胞所分泌的蛋白酶來影響細胞外基質分布、促進組織纖維化[11]；CTGF是受到TGF-β1調控的細胞因子，也可由炎性細胞大量分泌，能夠促進成纖維細胞發生增殖并參與組織纖維化的過程[12]。結果提示：塵肺患者體內高表達的miR-21能夠增加多種細胞因子的分泌，進而通過細胞因子的生物學活性來促進肺組織發生纖維化。

在塵肺患者發生肺纖維化的過程中，細胞因子大量分泌能夠直接影響細胞外基質中膠原蛋白水解和沉積的平衡，TGF-β1等細胞因子對蛋白酶活性的增強作用以及TNF-α等細胞因子對蛋白酶分泌的刺激作用能夠使細胞外基質中的膠原蛋白發生過度水解。MMP-9是具有強大膠原水解活性的蛋白酶，uPA是通過纖溶酶來參與組織纖維化調控的分子，該分子能夠使纖溶酶原活化為纖溶酶并促進細胞外基質不斷水解[13]。當細胞外基質內的膠原大量水解后，機體能夠進行自身代償并使多種類型的膠原在鄰近組織發生合成和沉積，膠原異常的降解和沉積共同促進了肺纖維化[14]。塵肺組患者血清MMP-9、uPA、Col-I、Col-III的含量明顯高于對照組，且與血清中膠原代謝指標的含量與外周血中miR-21的表達量呈正相關。這一結果表明塵肺患者體內高表達的miR-21能夠促進細胞外基質內的膠原代謝發生紊亂，進而通過膠原代謝的改變來促進肺組織發生纖維化。

塵肺病程中肺纖維化是局部組織自身修復的過程，而與塵肺患者局部肺組織損傷關系最密切的病理環節是氧化應激反應。粉塵在肺內潴留能夠促進氧自由基大量生成并與肺泡上皮、血管內皮、肺間質等發生氧化應激損傷，進而通過細胞外基質降解及沉積的改變來實現損傷修復，同時也逐步產生纖維化[15]。塵肺組血清中8-iso-PGF2α、NO的含量明顯高于對照組，且氧化產物與外周血中miR-21的表達量呈正相關，T-AOC、SOD的含量明顯低于對照組且抗氧化物與外周血中miR-21的表達量呈負相關。8-iso-PGF2α、NO是氧自由基引起組織氧化損傷過程中的產物，兩者含量能夠直接反映氧自由基的生成量，進而對氧化應激損傷的程度做出評估。SOD是具有還原活性的催化酶，通過介導還原反應來清除氧自由基并減輕組織所受到的氧化損傷，但持續大量生成的氧自由基會增加SOD的消耗并使T-AOC降低。本結果表明：塵肺患者體內高表達的miR-21能夠促進氧自由基的生成以及抗氧化物的消耗，進而通過氧化應激反應來造成組織損傷及纖維化。

總之，塵肺患者外周血miR-21的表達升高；高表達的miR-21能夠造成塵肺病程中細胞因子異常分泌、膠原代謝紊亂、氧化應激激活，進而引起肺纖維化。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

董明霞、劉麗：設計研究方案，實施研究過程，論文撰寫；龐波、李茜：提供材料，分析試驗數據;李娟：實施研究過程，進行統計學分析及論文審核修改