大禿馬勃培養基配方的優化

史 鑫，王宏杰，王鴻磊，丁 強，王紅艷

(中國農業大學 煙臺研究院，山東 煙臺 264670)

大禿馬勃(Calvatiagigantea)又名馬糞包，大馬勃，屬真菌界擔子菌門傘菌綱傘菌科禿馬勃屬真菌[1-3]。子實體近球形至球形，直徑15～36 cm或更大，不孕基部無或很小，常單生或群生于草地上，我國東北、華東及西南等地均有分布[4-6]。大禿馬勃子實體幼時白色，可以食用，味道鮮美，其蛋白質含量高達31.27%，遠高于香菇、金針菇和平菇等食用菌，且含有豐富的礦物質，是一種珍稀的食用真菌[7-8]。大禿馬勃也是一種重要的藥用真菌，具有清熱解毒、抗炎止血及抗癌抗腫瘤等功效[9-14]，其藥用價值在《本草綱目》中有記載，在《中國藥典》(2005 版)中被列為3種正品馬勃之一[15]。

大禿馬勃是一種極具開發潛力的食藥用真菌，但目前仍然靠人工采摘野生資源為主，遠不能滿足其在食品和醫藥領域的需要，發展大禿馬勃人工栽培勢在必行。目前，大禿馬勃的研究主要集中在抗腫瘤[16]、抗氧化[17]等生藥學方面和菌絲液體發酵[18]方面，對人工栽培的研究也僅限于仿野生栽培[19]，其生產周期長，產量低，尚沒有工廠化栽培的記錄。筆者所在課題組自野外采集到野生大禿馬勃1株，計劃對其生物學性質、種子制備、栽培方法等進行系統研究，以實現大禿馬勃的工廠化栽培。前期研究發現，大禿馬勃菌絲在普通PDA培養基上生長緩慢，其生長速度為1.179 4 mm/d，導致人工培養周期過長(>20 d)。鑒于此，利用響應面法對大禿馬勃菌絲培養基配方進行優化，旨在為縮短大禿馬勃菌種培養時間，提高其菌絲生長速率并實現工廠化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 大禿馬勃菌種 分離保藏于中國農業大學煙臺研究院微生物研究室。

1.1.2 培養基 PDA培養基(馬鈴薯20 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL)和基礎培養基(土豆浸粉6 g,KH2PO42.0 g,MgSO40.5 g,瓊脂20 g，水1 000 mL)，自制。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化 將大禿馬勃菌種接種于PDA培養基平板上，在24℃恒溫避光培養20 d，用Φ5 mm打孔器打取菌絲塊備用。

1.2.2 不同因素對大禿馬勃菌絲生長的影響

1) 最佳碳源。試驗設4個處理，即在基礎培養基中分別添加20 g/L的葡萄糖、蔗糖、紅糖和可溶性淀粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于碳源篩選培養基平板上，每個處理接種1塊，6次重復，24℃培養，從第9天開始，每2 d測量1次菌落直徑，計算菌絲生長量。以菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的碳源為最佳碳源。

菌絲生長量=(菌落直徑-菌絲塊直徑)/2

2) 最佳氮源。試驗設7個處理，在最佳碳源培養基中分別添加5 g/L的蛋白胨、大豆蛋白胨、胰蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、豆餅粉及黃豆粉。將大禿馬勃菌絲塊接種于氮源篩選培養基平板上，每個處理接種1塊，6次重復，24℃培養，從第8天開始，每2 d測量1次菌落直徑，計算菌絲生長量。以菌絲生長量最大、菌絲最為濃密的氮源為最佳氮源。

3) 淀粉濃度。試驗設5個處理，即在5 g/L豆餅粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養基中分別添加10 g/L、15 g/L、20 g/L、25 g/L及30 g/L淀粉。每個處理接種1塊，6次重復，24℃培養，觀察菌絲生長情況，當有1個平板的菌絲長到接近9 cm培養皿邊緣時試驗結束(下同)，開始測量菌絲生長量，記錄培養時間，確定最佳淀粉濃度。

4) 豆餅粉濃度。試驗設5個處理，即在15 g/L淀粉+6 g/L土豆浸粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養基中分別添加1 g/L、3 g/L、5 g/L、7 g/L和9 g/L豆餅粉。每個處理接種1塊，6次重復，24℃培養，觀察菌絲生長情況，記錄培養時間，確定最佳豆餅粉濃度。

5)土豆浸粉濃度。試驗設5個處理，即在15 g/L淀粉+7 g/L豆餅粉+2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂組成的培養基中分別添加2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L和10 g/L土豆浸粉。每個處理接種1塊，6次重復，24℃培養，觀察菌絲生長情況，記錄培養時間，確定最佳土豆浸粉濃度。

1.2.3 響應面法優化大禿馬勃菌絲培養基配方 根據單因素試驗結果確定影響大禿馬勃菌絲生長的試驗因素，選擇豆餅粉(A)、淀粉(B)和土豆浸粉(C)3個因素為自變量，以菌絲生長量為響應值(Y)，采用3因素3水平的Box-Behnken響應面分析法篩選大禿馬勃培養基最優配方；通過試驗結果進行多項式擬合回歸和方差分析，根據模型方程繪制大禿馬勃菌絲生長響應面曲面圖及等高線，并根據響應面曲線的陡峭程度及效應面的等高線形狀確定最優配方組合。

1.3 數據統計與分析

利用SPSS 13.0和Origin 7.5進行數據分析和繪圖，利用Design-Expert 7.1.3進行響應面法試驗設計與分析。

2 結果與分析

2.1 不同因素處理大禿馬勃菌絲的生長量

從圖1可見，不同碳源、氮源和不同濃度的淀粉、土豆浸粉和豆餅粉對大禿馬勃菌絲的生長有不同程度的影響。

2.1.1 碳源 大禿馬勃菌絲在以淀粉和蔗糖為碳源的培養基上生長速度較快，培養至第17天時部分平板的菌絲已接近培養皿邊緣，二者平均菌絲生長量相當，分別為2.931 cm和2.795 cm，但以淀粉為碳源培養的大禿馬勃菌絲密度更大，所以選擇淀粉為培養大禿馬勃菌絲的最佳碳源。

2.1.2 氮源 大禿馬勃菌絲在以豆餅粉和黃豆粉為氮源的培養基上生長速度較快，培養至第18天時，以豆餅粉為氮源培養的大禿馬勃菌絲生長量和菌絲密度均最大，其生長量為2.703 cm，所以選擇豆餅粉為培養大禿馬勃菌絲的最佳氮源。

2.1.3 淀粉 隨著淀粉濃度增大，大禿馬勃菌絲生長量呈先升后降趨勢。其中，當淀粉濃度為15 g/L時菌絲生長量達最大，為3.371 cm；繼續增大淀粉濃度則菌絲生長量反而下降。因此，最佳淀粉濃度以15 g/L為宜。

2.1.4 土豆浸粉 土豆浸粉對大禿馬勃菌絲生長的影響趨勢與淀粉的基本相同，也呈先升后降趨勢。即隨著土豆浸粉濃度增大大禿馬勃菌絲的生長量呈上升趨勢，當濃度為6 g/L時菌絲生長量達最大，為3.386 cm；濃度繼續增大則菌絲生長量下降。因此，最佳土豆浸粉濃度以6 g/L為宜。

2.1.5 豆餅粉 豆餅粉對大禿馬勃菌絲生長的影響趨勢與淀粉和土豆浸粉基本相同，亦呈先升后降趨勢。當豆餅粉濃度為1～7 g/L時大禿馬勃菌絲的生長量呈上升趨勢，并在濃度為7 g/L時達最大，為3.803 cm；繼續增大豆餅粉濃度則菌絲生長量下降。因此，豆餅粉濃度以7 g/L最佳。

圖1 不同因素處理大禿馬勃菌絲的生長量Fig.1 Effect of different factors on mycelia growth of C.gigantean

2.2 大禿馬勃菌絲培養基的最優配方

從表1可見，處理4的菌絲生長量最大，為3.925 cm，其次是處理9和處理5，分別為3.890 cm和3.875 cm；處理1最小，為2.905 cm。對試驗結果進行多項式擬合回歸得二項式擬合方程為各處理菌絲生長量(Y)進行二次回歸擬合，得方程Y=-0.38+0.34A+0.32B+0.29C+0.05AB+0.02AC+0.002 5BC-0.08A2-0.025B2-0.04C2。其中，模型P=0.002 3(<0.01)，擬合不足P=0.163 9(>0.05)，R2=0.934 2，說明，通過響應面法擬合所得二次回歸模型與實際值擬合度高，模型回歸達極顯著，模型與試驗各因素相關度好，試驗方法可靠且誤差小，能夠很好地分析和預測大禿馬勃菌絲的生長量。豆餅粉的二次項(A2)及豆餅粉與淀粉的交互作用(AB)的P值分別為0.000 3和0.006 0，均<0.01，說明，二者對菌絲生長量的影響達極顯著水平；豆餅粉(A)、淀粉(B)及土豆浸粉二次項(C2)的P值分別為0.013 1、0.034 5和0.015 0，均<0.05，說明，三者對菌絲生長量的影響達顯著水平；各因素對大禿馬勃菌絲生長量的影響依次為A2>AB>A>C2>B>B2>C>AC>BC。

表1 大禿馬勃菌絲培養基配方的響應面試驗方案與結果Table 1 The scheme and results of the response surface experiment for optimizing medium formula in mycelia growth of C.gigantean

從圖2可知，3個響應面均為開口向下的凸形曲面，說明，響應值存在極高值。響應曲面的等高線中心均位于-1～1，說明，菌絲生長的最優條件存在于所設計的因素水平范圍之內。3組交互效應的等高線形狀均為橢圓形，表示各因素的交互作用顯著。由此確定大禿馬勃菌絲培養基的最佳配方為2.0 g/L KH2PO4+0.5 g/L MgSO4+20 g/L瓊脂+7.10 g/L豆餅粉+14.11 g/L淀粉+6.00 g/L土豆浸粉，在此條件下菌絲生長量預計最大可達3.87 cm。根據最佳配方配制培養基對模型進行3次以上驗證試驗的結果表明，菌絲培養時間為11 d時平均菌絲生長量達3.795 cm，與預測值相比誤差為1.94%。說明，該試驗建立的因素與響應值的回歸模型科學合理，可以較好地預測大禿馬勃菌絲生長量。優化后大禿馬勃菌絲的生長速度為3.45 mm/d，為優化前的2.93倍，極大地提高了大禿馬勃的培養效率。

圖2 不同因素下大禿馬勃菌絲生長量的響應面和等高線Fig.2 Response surface and contour line of mycelia growth of C.gigantean under different factors

3 結論與討論

大禿馬勃是一種珍稀的食藥用真菌，具有廣闊的食品和醫藥開發價值[20-21]。由于野生資源有限，人工栽培是大禿馬勃開發的必由之路。研究結果表明，大禿馬勃菌絲培養的最優培養基配方為豆餅粉7.10 g/L、淀粉14.11 g/L、土豆浸粉6.00 g/L、KH2PO42.0 g/L、MgSO40.5 g/L及瓊脂20 g/L。此條件下菌絲生長速度達3.45 mm/d，培養時間縮短至11 d，平均菌絲生長量達3.795 cm。