煙草黑脛病生防芽孢桿菌的篩選及其田間防效

羅玉英，彭麗娟，丁繼林，付 順，李 雨*

( 1.貴州省煙草公司 遵義市公司，貴州 遵義 563000；2.貴州大學 煙草學院，貴州 貴陽 550025；3.江蘇中煙工業有限責任公司，江蘇 南京 210019)

煙草黑脛病(Phytophthoranicotianae)是貴州煙草生產上最具破壞性的土傳病害之一，每年由該病害造成的經濟損失近千萬元，嚴重影響煙農的經濟收入[1-3]。目前生產上大多采用化學藥劑防治，其使用年限較長，病原菌抗藥性逐年增加，農藥殘留及環境污染等負面效應也逐步增長[4-6]。因此，采用生物農藥進行煙草病害防治是目前研究的熱點領域[7-11]。

芽孢桿菌(Bacillusspp.)是當前生物防治研究中最常用的微生物種類[12-13]，芽孢桿菌具備產業化生產的前景，且具有作用機制多樣，生產成本低，易儲運，不易產生抗藥性，對人畜安全等優點，是生防制劑開發的重要方向。目前國內外已有多種性狀優良的天然芽孢桿菌分離菌株被制成活體微生物制劑并成功商品化應用，發展潛力巨大[14-15]。Gustafson 公司研發的生物殺菌劑BioYield由解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)FZB42和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)GB122 混合制成，已被應用于多種植物病害的防治[16]。我國最早由中國農業大學研制成由蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢桿菌等芽孢桿菌制成的增產菌系列產品，其在水稻、小麥、蔬菜和更多經濟作物上應用均表現出良好的增產和防病效果[17-18]。目前適宜于貴州煙草黑脛病防治的生防制劑開發及使用相對較少，許多報道證明貴州省烤煙產區該病害病原菌的抗藥性逐年增加[4-6]。鑒于此，從貴州省遵義市烤煙種植煙草黑脛病發病地塊采集健康煙株根際土壤，采用平板對峙法分離篩選對該病具有防治潛力的芽孢桿菌菌株，通過形態學特征、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析對其進行鑒定，并進行田間防效試驗，旨在為煙草黑脛病生物農藥芽孢桿菌制劑的研發提供新的生防菌資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 煙草黑脛病菌，由貴州大學農學院植物病理學教研室提供。

1.1.2 土樣采集 2017年從貴州省遵義市主要烤煙種植區選取煙草黑脛病發病地塊，5點取樣法從健康煙株根際采集土壤，將同一地塊土樣混合算1份土樣。具體采集時間、地點詳見表1。土樣使用無菌自封袋收集，土壤采集工具用75%酒精進行消毒，避免不同田塊之間土壤微生物混雜。

表1 煙草黑脛病發病土樣采集信息Table 1 Information of soil samples infected with tobacco black shank

1.1.3 試劑 30%甲霜·噁霉靈水劑，中農立華(天津)農用化學品有限公司生產。

1.1.4 培養基 LB培養基、PDA培養基、蛋白酶檢測培養基和纖維素酶檢測培養基，參照文獻[15-16]的方法配制。

1.2 方法

1.2.1 根際芽孢桿菌的分離與保存 采用稀釋平板法[19]分離，將土壤稀釋液在85℃的水浴鍋中水浴30 min以殺滅絕大部分非芽孢細菌。取100 μL稀釋液涂LB培養基平板，每濃度涂平板4個重復，于37℃下過夜培養。挑取不同的單菌落，純化菌株并保存于-80℃冰箱。

1.2.2 菌株的篩選 在PDA培養基上以煙草黑脛病菌為供試病原菌，通過平板對峙法[10-19]篩選防治煙草黑脛病效果明顯的生防菌株。通過初篩和復篩觀察是否產生抑菌圈，并利用十字交叉法測量其抑菌直徑；再通過特定平板檢測是否有生物膜、蛋白酶及纖維素酶的產生，選擇其中3株效果最好的菌株用于后續大田試驗。

抑菌率=[(對照組菌落直徑-處理組菌落直徑)/處理組菌落直徑]×100%

1.2.3 菌株的鑒定 參照文獻[20-24]的方法，通過形態學、生理生化特征及16S rDNA基因序列分析對篩選的菌株進行鑒定。

1) 菌落形態特征觀察。菌株接種至含有5 mL LB培養液的試管中，37℃過夜搖培，離心收集菌體，菌體用無菌水清洗3次，最后用無菌水重懸并稀釋至濃度1×108CFU/mL，在LB平板上滴加10 μL菌液，37℃過夜培養后觀察菌落形態。

2) 生理生化特征。根據《伯杰氏系統細菌學手冊》[22]對菌株的生理生化特性進行測定。

3) 分子生物學鑒定。50 mg/mL溶菌酶37℃水浴1 h處理菌體后，使用Biomiga細菌基因組DNA提取試劑盒提取。以基因組DNA為模板，采用16S rDNA 通用引物27F/1492R[23]進行PCR擴增，PCR產物驗證正確后送上海生工生物工程技術服務有限公司進行PCR產物測序。測序結果于NCBI數據庫進行BLAST比對分析，并利用CLUSTAL X軟件進行多序列比對和系統進化分析軟件MEGA 6中的Neighbor-Joining算法構建系統發育樹[24]。

1.2.4 田間防效試驗

1) 供試品種。云煙87。

2) 試驗設計。設5個處理，篩選的3株芽孢桿菌(編號為MT310，MT319和MT323)分別為1個處理，以藥劑30%甲霜·噁霉靈水劑為陽性對照，未進行任何藥劑處理的為空白對照，3次重復，每小區種30株煙，所有處理隨機區組排列。藥劑處理濃度及用量參考藥劑說明，煙苗移栽時灌根施用，施用2次；芽孢桿菌濃度為 108cfu/mL，50 mL菌液灌根施用，共施用3次，煙苗移栽時第1次灌根，后每隔7～10 d灌1次。2018年4月23日移栽，田間栽培管理方法與當地一致，不施用其他殺菌劑。

3) 田間調查。試驗在湄潭縣抄樂鎮進行。試驗地肥力均勻，2017年種植烤煙且黑脛病發病地塊。選取空白對照開始發病后到采收前共進行3次，調查各小區煙株黑脛病發病情況，以空白對照小區開始發生煙草黑脛病時進行第1次調查(2018年6月26日)。依據GB/T 23222-2008進行煙草黑脛病病害分級，計算病害的發病率和病情指數。

1.3 數據統計與分析

采用DPS處理數據，Duncan新復極差法進行方差分析[10]。

2 結果與分析

2.1 煙草根際土壤芽孢桿菌的篩選

2017—2018年從遵義烤煙主要種植區采集煙草主栽品種健康植株的根際土壤及根部組織共15份，從中分離保存芽孢桿菌562株(圖1)。其中，湄潭縣興隆鎮189株，鳳岡縣進化鎮71株，余慶縣松煙鎮92株，綏陽縣蒲場鎮50株，湄潭縣抄樂鎮160株。

注：A，稀釋涂板得到芽孢桿菌單菌落；B，純化菌株；C，保存菌株。Note: A, single bacillus colony obtained from dilution plate；B, purified strain；C, strain preservation.圖1 煙草根際土壤芽孢桿菌的分離Fig.1 Isolation of Bacillus strains from tobacco rhizosphere soil

2.2 煙草黑脛病菌拮抗芽孢桿菌的篩選及鑒定

2.2.1 生防芽孢桿菌篩選 以煙草黑脛病菌為供試病原菌，經初篩與復篩得到拮抗效果較好的芽孢桿菌3株，編號為MT310、MT319和MT323(圖2)，其對煙草黑脛病菌的抑菌率分別為77.1%、79.7%和79.9%。

注：A，初篩；B，復篩；CK，煙草黑脛病菌；MT310、MT319、MT323表示篩選到的具有拮抗效果的芽孢桿菌菌株。Note: A, preliminary screening; B, secondary screening; CK，Phytophthora nicotianae；MT310, MT319 and MT323 are Bacillus strains with an antagonistic effect.圖2 生防菌株MT310、MT319 和 MT323對煙草黑脛病菌的拮抗效果Fig.2 Antagonistic effect of MT310, MT319 and MT323 biological control strains against tobacco black shank

2.2.2 生防菌株的生物膜、蛋白酶和纖維素酶測定 蛋白酶和纖維素酶均為芽孢桿菌產生的細胞壁降解酶，可降解大多數植物病原菌細胞壁，使其菌絲破裂死亡[25]。植物有益芽孢桿菌可在根系表面形成結構復雜的生物膜，牢固定殖在植物根系，發揮其生防作用[14,16]。從圖3可見，MT310、MT319和MT323等3株芽孢桿菌均可產生較為復雜的生物膜結構，均可產生蛋白酶和纖維素酶。表明，3株菌株具有潛在的定殖植物根系和降解植物病原菌細胞壁的能力。

圖3 生防菌株 MT310、MT319和 MT323的菌落形態及其生物膜、蛋白酶和纖維素酶檢測Fig.3 Colony morphology,biological membrane, protease and cellulase of MT 310, MT 319 and MT323

biological control strains

2.2.3 生防菌株鑒定 從表2可見，3株菌株均為G+，均可分解葡萄糖、鼠李糖和甘露醇，產生過氧化氫酶和硝酸還原酶，甲基紅染色陽性，可液化明膠等特征。將3株菌株的測序結果與GenBank數據庫對比，菌株MT310和MT319與解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)具有很高的同源性，達100%，菌株MT323與枯草芽孢桿菌(B.subtilis)具有很高的同源性，達100%。MT310、MT319、MT323的16S rDNA基因序列已提交GenBank數據庫，序列號分別為MK103120、MK103121和MK213735。根據16S rDNA基因序列分析構建基因進化樹(圖4)顯示，株菌MT310和MT319與解淀粉芽孢桿菌聚在一個子分支上，MT323與枯草芽孢桿菌聚在一個子分支上，結合形態學、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析確定MT310和MT319為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，MT323為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。

表2 生防菌株 MT310、MT319和MT323的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of MT310, MT319 and MT323 biological control strains

注：+，陽性反應；-，陰性反應。
Note: +, positive reaction;-, negative reaction.

圖4 生防菌株MT310、MT319及MT323的16S rDNA基因進化樹Fig.4 16S rDNA gene evolutionary tree of MT310, MT319 and MT323 biological control strains

2.3 田間防效試驗

從表3可知，3株芽孢桿菌對煙草黑脛病均有一定防效(>60.0%)，但防效均不及目前生產中常用藥劑甲霜·噁霉靈(90.0%)的防效。其中，MT310防效最好，為70.1%；其次是MT323和MT319，分別為63.5%和60.2%，二者差異不顯著，但均與MT310差異顯著。

表3 生防菌株MT310、MT319及MT323對煙草黑脛病的田間防效Table 3 Control effect of 3 MT310,MT319 and MT323 biological control strains against tobacco black shank in field

3 結論與討論

從貴州省遵義市主要烤煙種植區，煙草黑脛病發病地塊采集健康煙株根際土壤，從中分離得到具明顯拮抗煙草黑脛病菌(P.nicotianae)能力的芽孢桿菌MT310、MT319和MT323，經形態學、生理生化特性及16S rDNA基因序列分析，確定菌株MT310和MT319為解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)，MT323為枯草芽孢桿菌(B.subtilis)。3株芽孢桿菌均能產生較為復雜的生物膜結構，均可產生蛋白酶和纖維素酶。其作為生防菌劑用于田間試驗，均對煙草黑脛病具有明顯的防效(>60%)。

我國活菌制劑生物農藥中，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)是目前施用最多的生防芽孢桿菌，僅次于蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)[16]。芽孢桿菌可產生多種抗菌物質抑制植物病原真菌。有研究認為，芽孢桿菌抗真菌活性來源于非核糖體合成途徑產生環脂肽類抗生素，這些次生代謝產物可抑制菌絲生長及孢子萌發[14-16]。該研究分離到3株芽孢桿菌均產生蛋白酶和纖維素酶，可能是其抑制煙草黑脛病病原菌(P.nicotianae)的機制之一，對于其他可能的生防機制有待進一步研究。

2018年湄潭縣抄樂鎮6—8月降雨較少，不適宜病害發生與流行。因此，試驗地塊煙草黑脛病發病較輕，較有利于生防菌劑防治效果的發揮。3株芽孢桿菌均對煙草黑脛病具明顯防效，但與甲霜·噁霉靈比較，防效相對較差，田間施用次數多1次。有報道表明，生產中煙草黑脛病菌已對甲霜靈·錳鋅產生抗藥性[4-6]。因此，結合化學藥劑和生物殺菌劑的優缺點，可嘗試生防菌株與化學農藥復配施用，以達到減少化學農藥用量的目的。下一步還將繼續尋找貴州生態區域和種植模式下的拮抗芽孢桿菌(Bacillusspp.)，并研究開發生物制劑，以減少農藥使用和農藥殘留，保障貴州煙草的綠色生產。