響應面法優化橘核中3種檸檬苦素類成分的超聲輔助提取工藝

郁林娜，程盛勇，付洋，魯文琴，劉興賦，羅喜榮，*，楊軍

（1.貴州醫科大學藥學院，貴州貴陽550025；2.貴州醫科大學附屬醫院，貴州貴陽550004；3.中國科學院地球化學研究所，貴州貴陽550081）

檸檬苦素類化合物是存在于蕓香科和楝科植物中的四環三萜類次生代謝產物，在柑橘類果實的核、內果皮和囊衣等部位均有分布，以果核中含量最高（1%左右），主要為檸檬苦素、諾米林和黃柏酮，是引起柑橘味苦的重要原因之一。檸檬苦素類化合物可增強體內谷胱苷肽S轉移酶（glutathione S-transferase，GST）的活性，能抑制由化學物質引起的口腔癌、肺癌、肝癌、乳腺癌、結腸癌、宮頸癌等腫瘤，具有鎮痛消炎、抗瘧、抗焦慮、抗高血壓、抗菌、抗病毒、殺蟲等作用，被認為是潛在的防癌劑，作為功能性食品配料和醫藥原料具有良好的開發應用前景[1-7]。

目前國內外有關檸檬苦素的提取研究較多，鮮見諾米林的提取研究報道，尚未見檸檬苦素、諾米林和黃柏酮同時提取的文獻報道[8-16]。本文以檸檬苦素、諾米林和黃柏酮總得率為響應指標，采用Box-behnken響應面法優化超聲輔助提取工藝，以期為檸檬苦素類化合物的開發利用提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

橘核：產自浙江懼州，粉碎并過60目篩，30倍量石油醚回流脫脂后干燥備用；檸檬苦素、諾米林標準品（純度均＞98%）：貴州醫科大學藥學院天然產物實驗室自制；黃柏酮標準品（批號116A022，純度＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；乙腈為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其余試劑均為分析純。

Agilent 1290 DAD超高效液相色譜儀：美國Agilent公司；UC-10H加熱超聲波清洗器：上海泰坦科技股份有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器：上海浦東物理光學儀器廠；TGL-16G高速臺式離心機：上海安亭科學儀器廠；BSA224S電子天平：賽多利斯科學儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 檸檬苦素類成分的含量測定

1.2.1.1 色譜條件

色譜柱：UItimate AQ-C18（2.1 mm×100 mm）；流動相：乙腈-水（45∶55，體積比）；柱溫：30℃；流速：0.21 mL/min；檢測波長：210 nm；進樣量：0.8 μL。

1.2.1.2 標準品溶液制備

取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮標準品適量置10 mL量瓶，加甲醇溶解、定容，制得標準儲備液，采用逐級稀釋法配制系列標準工作溶液，按“1.2.1.1”項下條件檢測。

1.2.1.3 供試品溶液制備

取橘核粉3.00 g置100 mL具塞錐形瓶，加入溶劑混勻、稱重，于不同溫度下超聲輔助提取一定時間后冷卻、稱重并補足減失的重量、過濾。取供試品溶液按“1.2.1.1”項下條件檢測，根據標準曲線測定檬苦素、諾米林、黃柏酮濃度，計算檸檬苦素類成分總得率Y=Y1+Y2+Y3。

1.2.2 單因素試驗設計

以檸檬苦素類成分總得率為評價指標，固定其他條件不變，分別考察不同提取溶劑（石油醚、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、丙酮、異丙醇、無水乙醇、95%乙醇、甲醇、乙腈、水）、提取時間（10 min～90 min）、提取溫度（20 ℃～60 ℃）、液料比[5 ∶1（mL/g）～25 ∶1（mL/g）]對檸檬苦素類成分提取的影響，確定工藝優化取值范圍。

1.2.3 響應面試驗設計

根據單因素試驗結果，選擇提取時間、提取溫度、液料比為考察因素，以檸檬苦素類成分總得率Y/（mg/g）為響應指標，采用Box-behnken響應面法設計三因素三水平試驗方案優化工藝條件，見表1。

表1 試驗因素編碼及水平Table 1 Code and level of experimental factors

2 結果與分析

2.1 檸檬苦素類成分的含量測定

2.1.1 專屬性

取標準品溶液和供試品溶液按“1.2.1.1”項下條件檢測，結果見圖1。

圖1 標準品（A）和供試品（B）超高效液相色譜圖Fig.1 Ultra performance liquid chromatograms of reference substances（A）and sample（B）

由圖1可知檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的保留時間分別為3.07、3.95、5.54 min，各色譜峰完全分離且無雜質峰干擾，表明方法專屬性良好。

2.1.2 標準曲線

以濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮的回歸方程分別為：Y1=1.965 5X-13.268 0（3.71 μg/mL～1 900 μg/mL，R2=0.999 5）；Y2=1.786 1X-9.153 2（2.93 μg/mL～1500 μg/mL，R2=0.9998）；Y3=4.5880X-40.0650（3.71μg/mL～950μg/mL，R2=0.9994）。

2.2 單因素試驗

提取溶劑、提取時間、提取溫度和液料比對檸檬苦素類成分總得率的影響見圖2。

圖2 各因素對檸檬苦素類成分總得率的影響Fig.2 Effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed

由圖2可知，以甲醇作提取溶劑時，檸檬苦素類成分總得率最高；隨著提取時間延長、提取溫度升高、液料比增加，檸檬苦素類成分總得率均先增幅明顯，隨之變緩并趨于平穩，說明目標物質的溶出基本完全，故確定提取時間、提取溫度、液料比的最佳取值范圍分別為10 min～50 min、20 ℃～40 ℃、5 ∶1（mL/g）～15 ∶1（mL/g）。

2.3 響應面試驗

2.3.1 試驗結果及回歸模型分析

響應面試驗結果見表2，回歸模型的方差分析見表3。

表2 響應面試驗設計及結果Table 2 Experimental design and results of response surface

續表2 響應面試驗設計及結果Continue table 2 Experimental design and results of response surface

表3 回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for fitted quadratic polynomial model

應用Design Expert 10.0.7軟件對表2數據進行完全二次方程擬合，得檸檬苦素類成分總得率的回歸方程：Y=-11.127 7+0.233 4A+0.695 8B+1.097 6C-0.002 3AB+0.004 4AC-0.000 3BC-0.002 7A2-0.009 2B2-0.0505C2。由表3可知模型P＜0.01，表明該模型極顯著；失擬項P＞0.05不顯著，說明試驗誤差小；R2=0.988 3，R2Adj=0.967 2，表明該模型擬合度良好；A、B、C 和 A2、B2、C2對檸檬苦素類成分提取影響極顯著，AB、AC對檸檬苦素類成分提取影響顯著。

2.3.2 響應曲面分析與優化

采用Design Expert 10.0.7軟件繪制響應面圖和等高線圖，見圖3。

由圖3響應面圖可知液料比對檸檬苦素類成分提取影響最為顯著，表現為曲面較陡，提取時間影響次之，提取溫度相對影響最小；由圖3等高線圖可知，提取時間和提取溫度交互作用對檸檬苦素類成分提取影響最大，表現為等高線呈較扁的橢圓形，提取時間和液料比交互作用影響次之，提取溫度和液料比交互作用影響較小。通過Design Expert 10.0.7軟件分析，得到檸檬苦素類成分最佳提取工藝條件：提取時間39.99 min、提取溫度 32.56℃、液料比 12.54 ∶1（mL/g）。

2.3.3 驗證試驗

為方便實際操作將最佳提取工藝參數調整為提取時間 40 min、提取溫度 33℃、液料比 13∶1（mL/g），經3次驗證試驗，檸檬苦素類成分平均總得率為11.804 5 mg/g，與模型預測值11.756 9 mg/g的偏差為0.404 9%，表明該模型預測性良好，具有實用價值。取優化條件供試品溶液回收甲醇得干燥品，按“1.2.1”項下方法測得檸檬苦素類物質純度72.642 5%，其中檸檬苦素36.599 4%、諾米林29.662 8%、黃柏酮6.380 3%，表明基于該工藝可有效獲得高純度檸檬苦素類化合物。

圖3 各因素對檸檬苦素類成分總得率影響的響應面和等高線圖Fig.3 Responsive surface and contour of effects of each factor on extraction yield of three limonoids constituents in citrus seed

3 結論

我國柑橘資源豐富，其產量居世界首位，但柑橘加工業還十分落后，大量的副產物沒有合理利用，特別是橘核由于味苦，通常被當作生活垃圾丟棄。若能高效合理地提取檸檬苦素類化合物，并將其投至食品醫藥行業發展，將會帶來顯著的經濟和社會效益。

超聲輔助提取是常用的中藥提取方法，具有快速、高效、環保，且設備簡單、操作方便等特點[17]。本文應用響應面法首次建立了橘核中3種檸檬苦素類成分的超聲輔助提取方法，得到優化提取工藝條件為甲醇作提取溶劑、提取時間40 min、提取溫度33℃、液料比13∶1（mL/g），此條件下檸檬苦素類成分總得率為11.804 5 mg/g，產物中檸檬苦素類物質純度高，有利于檸檬苦素、諾米林和黃柏酮的后續單體純化，對其新型保健食品和新藥研發有重要意義。本工藝具有經濟、高效、合理、重復性好等特點，用于柑橘果實中檸檬苦素類化合物的提取切實可行，為檸檬苦素類化合物的進一步開發利用奠定了基礎。