超聲波輔助提取玫瑰茄多糖工藝研究

（福建農業職業技術學院，福建福州350003）

植物多糖具有抗血栓、降血糖[1]、增強免疫力[2]、抗氧化、抗衰老、抗病毒、抗腫瘤[3]、免疫調節[4]等多種生物學功能[5]，因此成為近年來研究熱點。植物多糖提取方法主要有超濾法、溶劑提取法、酸提法、堿提法、酶解法、微波輔助提取法、超聲波輔助提取法等[6]。其中超聲波輔助提取多糖具有時間短、節約成本[7]、提取速度快、溶劑消耗少、提取效率高、操作簡便及對天然產物破壞少等優點[8]，目前廣泛應用于天然產物提取[9]。

玫瑰茄（Hibiscus sabdariffa L.），又名洛神花（roselle）、洛神葵、山茄等[10]，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物[11]。玫瑰茄廣泛生長在熱帶和亞熱帶地區，在中國廣東、廣西、云南、福建等有栽培[12]。玫瑰茄花萼可藥食兩用，含有豐富的維生素C、維生素E、氨基酸、蛋白質、多種礦物質[13]、酚酸類、類黃酮類、花青素等營養物質[14]，具有抗癌、抗高血糖、降血脂、抗炎癥、改善消化系統等藥理作用[15-16]。玫瑰茄花青素提取研究近年來漸有報道[17]，但未見玫瑰茄多糖相關報道。本文以玫瑰茄干花萼為原料，以玫瑰茄多糖提取率為評價指標，正交試驗優化超聲波輔助提取玫瑰茄多糖工藝，為玫瑰茄進一步開發利用及工業化生產提供了理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄：市售；D-無水葡萄糖：美國Sigma；濃硫酸、乙醇、苯酚、氯仿：試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

DHF-9055A型電熱鼓風干燥箱：上海一恒科技有限公司；AB204-N型電子天平：上海上平儀器有限公司；Alpha-1502紫外可見分光光度計、HWS-26型電熱恒溫水浴鍋：上海譜元儀器有限公司；LGR10-4.2高速冷凍離心機：上海安亭科學儀器廠；As-BDT超聲波清洗器：天津奧特塞恩斯儀器有限公司。

1.3 玫瑰茄多糖的測定方法

1.3.1 樣品處理

挑選色澤明亮并剔除傷爛病蟲花萼的玫瑰茄，用清水洗凈玫瑰茄，切開花的底部，頂出果核后在烘箱內60℃烘干12 h，然后進行粉碎。粉碎后密封保存。

1.3.2 玫瑰茄多糖提取工藝流程

玫瑰茄多糖提取采用水浸醇析法提取。將烘干的玫瑰茄粉碎過篩，超聲波輔助提取，提取液抽濾除雜，濃縮至原體積1/3，按體積比1∶4加入80%乙醇，冷凍離心10 min，反復多次收集沉淀，得玫瑰茄多糖與蛋白質混合物，沉淀用蒸餾水溶解，活性炭脫色后，用Sevage試劑（正丁醇 ∶氯仿=4∶1，mL/mL），脫蛋白 5次，將上清液定容至100 mL容量瓶中，搖勻得玫瑰茄多糖提取液[18]。

1.3.3 標準曲線的繪制

采用苯酚-硫酸法測定多糖[19]，以葡萄糖作為標準品，精確吸取葡萄糖標準液（0.500 mg/mL）0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于 7 個 100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，搖勻。再分別精確吸取上述溶液2.0 mL于25 mL比色管中，依次加入1.0 mL苯酚溶液（6%），搖勻后加入5.0 mL濃硫酸，迅速搖勻后靜置30 min，以蒸餾水為空白，在波長為490 nm處測定吸光度，以葡萄糖標準濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線[20]。

1.3.4 多糖提取率的計算

精確吸取4.0 mL玫瑰茄多糖提取液于100 mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。按葡萄糖標準曲線繪制方法在波長490 nm處測定吸光度[21]。其計算公式為：

式中：C為玫瑰茄多糖質量濃度，mg/mL；N為稀釋倍數；V為玫瑰茄多糖提取液定容的體積，mL；M為玫瑰茄干粉質量，g。

1.4 方法

1.4.1 單因素試驗

以水為提取液，選擇固液比、超聲波功率、提取時間和提取溫度4個因素，以多糖提取率為衡量標準，進行單因素試驗。

1.4.2 正交試驗

在單因素試驗基礎上，確定固液比，超聲波功率，提取溫度和提取時間為主要影響因素，以玫瑰茄提取率為評價指標，設計L9（34）正交試驗優化提取工藝參數，正交試驗因素及水平見表1。

表1 正交試驗因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

1.5 數據分析

所有試驗均重復3次，結果取平均值，試驗數據采用DPS數據處理軟件和Excel2016軟件進行分析處理。

2 結果與分析

2.1 葡萄糖標準曲線

葡萄糖標準曲線回歸方程y=6.982 1x+0.000 5，R2=0.999 6，式中：x為葡萄糖質量濃度，mg/mL；y為吸光度，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose

結果表明葡萄糖在質量濃度0.00mg/mL～0.06mg/mL范圍內與吸光度有良好的線性關系。

2.2 單因素試驗

2.2.1 固液比對玫瑰茄多糖提取率的影響

在提取溫度40℃、超聲波功率210 W、提取時間10 min的條件下，探討固液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35（g/mL）對玫瑰茄多糖提取率的影響見圖2。

由圖2可知，固液比在 1 ∶10（g/mL）～1 ∶20（g/mL）時，玫瑰茄多糖提取率隨著溶液體積增大而增加，在1∶20（g/mL）處達到最大，其后多糖提取率反而下降，總體上低溶液體積提取率高于高溶液體積提取率。其原因是隨著溶液體積增大，溶劑用量增加，多糖浸出率隨之增大，但當溶劑用量增加到一定值時，超聲波輻射被溶劑大量吸收，溶劑溶解雜質也增多，而不能完全作用于樣品。因此，選取固液比 1 ∶10、1 ∶15、1∶20（g/mL）進行正交試驗。

圖2 固液比對玫瑰茄多糖提取率影響Fig.2 The effect of ratio of solid to liquid on extraction efficiency

2.2.2 超聲波功率對玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比1∶20（g/mL）、提取溫度40℃、提取時間10 min的條件下，探討超聲波功率對玫瑰茄多糖提取率的影響見圖3。

圖3 超聲波功率對玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.3 The effect of ultrasonic power extraction efficiency

由圖3可知，隨著超聲波功率的升高，多糖提取率先增加后降低，當超聲波功率達到270 W時，提取率最高。其原因是機械作用隨著超聲波功率增大而增強，分子擴散速度增大，多糖浸出率增大，雜質也增多。因此，選取240、270、300 W進行正交試驗。

2.2.3 提取時間對玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比為1∶20（g/mL）、提取溫度40℃、超聲波功率270 W的條件下，探討提取時間10、20、30、40、50 min對玫瑰茄多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.4 The effect of extraction time on extraction efficiency

由圖4可知，隨著提取時間的延長，多糖提取率先升高后下降，以30 min為界點，30 min前提取率隨著提取時間延長而升高，30 min后提取率隨著提取時間延長而下降，其原因是長時間提取會使多糖分子在空化作用和機械作用下發生降解和破壞，使雜質溶出，導致多糖提取率下降。因此，選取30、40、50 min進行正交試驗。

2.2.4 提取溫度對玫瑰茄多糖提取率的影響

在固液比為 1∶20（g/mL）、超聲波功率 270 W、提取時間 30 min的條件下，探討提取溫度 40、50、60、70、80℃對玫瑰茄多糖提取率的影響見圖5。

圖5 提取溫度對多糖提取率的影響Fig.5 The effect of extraction temperature on extraction efficiency

由圖5可知，當溫度達60℃時，多糖提取率達到最大值，溫度再升高多糖提取率反而下降，其原因是溫度升高，分子運動速度加快，多糖容易從細胞中轉移到溶質中，但是溫度過高，部分多糖化合物容易被氧化破壞，會產生雜質，不利于后續的分離。因此，選取50、60、70℃進行正交試驗。

2.3 正交試驗

按1.4.2方法來設計L9（34）正交試驗，得玫瑰茄多糖最佳提取工藝參數，并考察各因素對玫瑰茄多糖提取率影響的主次順序。正交試驗方案及結果見表2，方差分析見表3。

表2 正交試驗方案及結果Table 2 Orthogonal test results of extraction technology

續表2 正交試驗方案及結果Continue table 2 Orthogonal test results of extraction technology

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance of orthogonal test

由表2極差分析得出，各因素對玫瑰茄多糖提取率影響主次順序依次為固液比（A）＞超聲波功率（B）＞提取時間（C）＞提取溫度（D）。由表3方差分析檢驗可知，固液比、超聲波功率和提取時間達到顯著水平（P＜0.05），說明上述三因素對玫瑰茄多糖提取率有顯著影響。因此，玫瑰茄多糖提取最佳工藝為：A3B2C1D2，即超聲波功率為270 W，固液比1∶20（g/mL），提取溫度為60℃，提取時間為30 min。在此條件下，玫瑰茄多糖提取率最高。

2.4 驗證試驗

由正交試驗可知，試驗結果最好的方案為A3B2C1D2，而正交表中沒有該方案組合，為進一步考察上述提取工藝結果的準確性，按照最優組合A3B2C1D2進行驗證試驗，平行測定5次，取平均值，測得玫瑰茄多糖平均提取率為56.66%，大于正交試驗結果中多糖最高提取率52.91%，相對標準偏差（RSD值為0.47%），表明該方法重復性良好，適合玫瑰茄多糖提取。

2.5 提取次數對玫瑰茄多糖提取率的影響

設超聲波功率270 W，提取時間為30 min，固液比為 1 ∶20（g/mL），提取溫度為 60 ℃，分別提取 1、2、3次，結果如圖6所示。

由圖6可知，多糖提取率隨提取次數增加而提高，提取3次，提取率最大。但增加提取次數不但多糖提取率變化不大，還會導致大量雜質溶出，為了節約成本，提取次數以2次為宜。

圖6 提取次數對玫瑰茄多糖提取率的影響Fig.6 The effect of extraction times on extraction efficiency

3 結論

超聲波輔助提取玫瑰茄多糖高效可行，工藝簡單，其影響因素主次順序為固液比＞超聲波功率＞提取時間＞提取溫度。工藝參數為超聲波功率270 W，提取溫度 60℃，固液比 1∶20（g/mL），提取時間 30 min，提取2次。在此條件下，玫瑰茄多糖提取率最高，為60.35%。

超聲波輔助提取作為一種先進的提取方法，通過超聲波對細胞壁產生的破碎效應，從而可以提高了提取成分的效率，是一種高效、快速、環保的提取方法。超聲波提取技術應用于玫瑰茄多糖的提取，具有省時、高效、節能、穿透力強、選擇性高、有效成分溶出快等特點。更重要的是提取過程避免高溫，從而預防因高溫對玫瑰茄多糖分子結構的破壞，為玫瑰茄多糖提取實現工業化生產提供了理論依據，對充分利用玫瑰茄資源有現實參考意義。