黃皮果果核揮發油對小鼠黑色素瘤B16-F10細胞增殖和凋亡的影響

廖雪華，甘育鴻，梅思，符偉玉，吳科鋒，4，*，李文德

（1.廣東醫科大學廣東天然藥物研究與開發實驗室，廣東湛江524023；2.梅州市人民醫院，廣東梅州514000；3.廣東醫科大學生物化學與分子生物學研究所，廣東湛江524023；4.廣東醫科大學南海海洋醫藥研究院，廣東湛江524023；5.廣東省實驗動物監測所，廣東廣州510000）

黑色素瘤又稱惡性黑色素瘤，是由分布于神經嵴黑色素細胞所形成的痣或色素斑惡化而成，其惡性程度高，具有高度侵襲性，易發生轉移，是目前為止導致死亡人數最多的皮膚腫瘤[1-2]。黑色素瘤主要發生在皮膚，但也可發生于眼睛、腸道及體內含有黑色素細胞的任何部分[3-4]。早期黑色素瘤可以通過手術切除達到有效治療，但中晚期惡性黑色素瘤對常規的放療、化療不敏感，缺乏有效的治療手段[5-6]，且常規的化療藥物存在不良反應大，患者依從性差等特點[7]。因此，從天然的中藥材中尋找有效的抗黑色素瘤藥物成為研究的熱點。

黃皮果為蕓香科植物黃皮 [Clausena lansium（Lour.）Skeels]的成熟果實，是藥食同源的民間藥材，其肉、皮和核皆可入藥[8]。黃皮果核具有行氣止痛、健胃消腫等多方面的生物活性，常用于治療胃痛、疝痛、痛經和風濕骨痛[9]。大量文獻報道，黃皮果揮發油主要成分為萜類、醇類、酯類、酮類及醛類，進一步的研究也指出，該揮發油具有殺蟲、抑菌、抗氧化等作用[10-11]。前期研究發現黃皮果核揮發油主要成分為烯醇類，占揮發油成分的56.74%以上，并可改善因紫外線引起的皮膚老化損傷[12]，而對于其抗腫瘤活性及其他生物活性的研究鮮見報道。因此希望進一步探究該揮發油抗黑色素瘤細胞增殖作用的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞株

小鼠黑色素瘤B16-F10細胞：中國科學院細胞庫。

1.2 試劑與儀器

黃皮果核揮發油（essential oil of kernel，EOK）：廣東醫科大學天然藥物研究與開發重點實驗室保存[12]；磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶（Annexin V-FITC/propidiun iodide，Annexin V-FITC/PI） 細胞凋亡檢測試劑盒：北京莊盟國際生物基因科技有限公司；0.25%胰酶溶液（1x）：吉諾生物醫藥技術有限公司；超敏ECL（electro-chemi-luminescence）化學發光試劑盒（BeyoECL Plus）、羅丹明 123（rhodamine 123，Rh 123）、放射免疫沉淀（radio immunoprecipitation assay，RIPA）裂解液、二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒：碧云天生物技術研究所；胎牛血清、高糖培養基（dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）、磷酸鹽緩沖液（phosphote buffered soline，PBS）：美國 Gibco公司；青霉素-鏈霉素雙抗溶液：廣州威佳科技有限公司；3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴鹽[3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：Sigma 公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）：美國 SANTA CRUZ公司；十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE） 凝膠快速配置試劑盒：北京鼎國昌盛生物技術有限公司；預染蛋白標記：美國 Thermo公司；β-肌動蛋白（β-actin）、辣根過氧化物酶標記的二抗、P65、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3等一抗：美國SAB公司；一抗稀釋液、二抗稀釋液：Biosharp公司；0.22 μm聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）：美國 Millipore公司。

IX73型倒置熒光顯微鏡：Olympus公司；通用水套CO2培養箱：美國Thermo公司；SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺：江蘇蘇凈集團有限公司；HR/T16MM微量高速冷凍離心機：湖南赫西儀器裝備有限公司；SHA-B數顯恒溫水浴震蕩器：天津賽得利斯實驗分析儀器制造廠；AUW120D型電子分析天平：日本SHI－MADAU公司；迷你雙垂直電泳槽、轉印系統：美國Bio-Rad公司；Epoch 酶標儀：美國 Bio-Tek；EPICS XL-MCL流式細胞儀：美國BECKMAN COULTER公司。

1.3 方法

1.3.1 黃皮果果核揮發油（essential oil of kernel，EOK）的提取與分離

稱取一定量黃皮果核，加水浸泡后采用水蒸氣蒸餾法提取揮發油，冷卻后收集揮發油。采用冷凍結晶法分離得到液態揮發油。通過氣相色譜-質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS） 分析顯示，在EOK中檢測到33種化合物，其主要化合物是烯醇類，主要成分含量占56.74%。

1.3.2 細胞培養

B16-F10細胞均培養于含10%胎牛血清的DMEM培養基中，置37℃、5%CO2的培養箱中培養。待細胞長至80%左右時，按1∶3或1∶2傳代，取對數生長期細胞進行試驗。

1.3.3 MTT法檢測細胞存活率

取對數生長期的細胞以3.5×103個/孔均勻接種于96孔板，置37℃、5%CO2培養箱，待細胞貼壁后，加入不同濃度的 EOK（0.2、0.4、0.6、0.8 μL/mL），空白組加入等量生理鹽水，每組6個復孔，分別孵育24、48、72 h 后吸取上清液，每孔加入 MTT（5 g/L）20 μL，繼續培養4 h，隨后小心吸出培養液，加入DMSO 150 μL/孔溶解甲鐕，振蕩搖勻，結晶完全溶解后，酶標儀于波長570 nm處測量各孔的吸光度（OD值），并計算細胞抑制率。

1.3.4 觀察細胞形態

取對數生長期的細胞以2×104個/孔均勻接種于12孔板，置于37℃、5%CO2培養箱中培養至細胞貼壁，將培養基更換為不同濃度的含EOK培養基，在37℃孵育24 h后，將培養液更換為適量的PBS，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.5 細胞凋亡檢測

取對數生長期的細胞以5×104個/孔均勻接種于6孔板，置37℃、5%CO2培養箱培養至細胞貼壁。將培養基更換為不同濃度的含EOK培養基，37℃孵育24 h后，用胰酶消化收集細胞于1.5 mL試管中，在4℃、2 000 r/min條件下離心5 min，棄去上清液，用PBS洗滌2遍。細胞懸浮于500 μL的緩沖液中，添加5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體并混勻，再加入碘化丙啶試劑10 μL，室溫避光反應15 min，然后在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.3.6 線粒體膜電位的檢測

取對數生長期的細胞以5×104個/孔均勻接種6孔板，置37℃、5%CO2培養箱培養至細胞貼壁。將培養基更換為不同濃度的EOK培養基，37℃孵育24 h后，用無血清培養基洗滌1次，加入稀釋好的Rh123工作液（20 μmol/L）1 mL，置細胞培養箱內繼續孵育20 min，PBS洗滌3次，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.7 蛋白免疫印跡試驗

RIPA裂解液按試劑盒說明書要求裂解細胞，分離上清液，即細胞總蛋白。BCA法測定蛋白濃度，10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉膜。將印跡的聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF）依次進行封閉、加入對應的一抗、二抗、抗體結合區帶加入電化學發光顯色液，掃描后保存。以β-actin為內參，分析各組細胞目的蛋白相對表達量。

1.3.8 統計學方法

2 結果與分析

2.1 黃皮果果核揮發油對小鼠黑色素瘤B16-F10細胞增殖抑制的影響

通過MTT法檢測EOK對小鼠黑色素瘤細胞B16-F10細胞的抗增殖活性，結果如圖1所示。

圖1 EOK對B16-F10細胞增殖的影響Fig.1 Effect of EOK on the growth of B16-F10 cells

當揮發油濃度為0.2 μL/mL，作用24 h后，對小鼠黑色素瘤B16-F10細胞的抑制率為（5.67±3.25）%，但差異無統計學意義；當作用48、72 h后，抑制率分別為（44.65±3.96）%、（53.39±4.70）%（P＜0.01）。當藥物濃度分別為0.4、0.6、0.8 μL/mL時，隨著作用時間的增加，細胞增殖抑制率明顯升高，且呈現濃度依賴性和時間依賴性。由此可見，EOK對小鼠黑色素瘤B16-F10細胞具有明顯的增殖抑制作用。

2.2 黃皮果果核揮發油對細胞形態影響

EOK處理24 h對B16-F10細胞形態變化的影響結果見圖2。

圖2顯示，對照組細胞貼壁狀態良好，緊密排列，呈不規則梭形（圖2A）；與對照組相比，EOK作用24 h后，0.2 μL/mL、0.4 μL/mL 組細胞變長，細胞間隙增大，呈現樹突網狀結構，且有黑色顆粒物；隨著藥物濃度的增加，細胞數量逐漸減少，細胞形態也驟變，0.8 μL/mL細胞體積明顯縮小，呈現固縮的圓形結構，黑色顆粒物不明顯，漂浮在細胞培養液中的細胞增多。從形態方面預示著B16-F10細胞處于凋亡狀態。

圖2 EOK處理24 h對B16-F10細胞形態變化的影響Fig.2 EOK deal with the effect of 24 h on the morphological changes of B16-F10 cells

圖3 Annexin V-FITC/PI雙染的流式細胞術檢測細胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of B16-F10 cells detected by flow cytometric analysis

2.3 黃皮果果核揮發油對B16-F10細胞凋亡的影響

Annexin V-FITC染色觀察B16-F10細胞凋亡情況見圖3。

細胞凋亡的檢測方法有很多中，各有其特點。流式細胞術檢測細胞凋亡，具有快速、靈敏度高、可以定量等優點。其中Annexin V-FITC/PI雙標記染色最為常用。磷脂酰絲氨酸（phasphatidylserine，PS）正常位于細胞膜的內側，但在細胞凋亡的早期，由于細胞膜失去對稱性，PS可從細胞膜的內側翻轉至細胞膜的表面，暴露在細胞外環境中。磷脂結合蛋白V（Annexin V）是一種鈣依賴的磷脂結合蛋白，它與PS高親和力特異性結合。熒光素FITC標記的Annexin V可作為探針檢測暴露在細胞膜外側的的PS，指示凋亡細胞，但壞死細胞PS也會顯露在外表使Annexin V-FITC結合成陰性，必須加入碘化丙啶（propidiun iodide，PI）才能區分壞死細胞[13-14]。碘化丙啶是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能通過細胞膜而使細胞核著色。流式細胞儀分析結果顯示，與對照組（圖3A）比較，隨著EOK濃度的增加，凋亡比例也隨著增加，其誘導B16-F10細胞凋亡率分別為5.66%、30.34%、36.04%。這表明EOK能誘導B16-F10細胞凋亡。

2.4 黃皮果果核揮發油對B16-F10細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）的影響

羅丹明123（rhodamine 123）是一種可透過細胞膜的陽離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進入線粒體基質，熒光強度減弱或消失。而在凋亡發生時，線粒體膜完整性破壞，線粒體膜通透性轉運孔開放，引起線粒體跨膜電位（ΔΨm）的崩潰，Rh123重新釋放出線粒體，從而發出強黃綠色熒光，因此可以根據相對熒光信號的強度來衡量MMP的變化[15]。熒光染色法檢測B16-F10細胞線粒體膜電位水平見圖4。

圖4 熒光染色法檢測B16-F10細胞線粒體膜電位水平Fig.4 Detection of mitochondrial membrane potential level of B16-F10 cells by fluorescent staining

從圖4中可以看出，EOK處理24 h后，與對照組比較，藥物處理組細胞內的熒光明顯增強，而且隨著濃度增大而增強，高濃度組所發熒光非常顯著，說明線粒體膜完整性可能已破壞，引起ΔΨm的崩潰，并隨藥物濃度的不同而使MMP出現不同程度的受損。結果表明EOK誘導細胞凋亡與抑制線粒體膜電位密切相關。

2.5 黃皮果果核揮發油對B16-F10細胞凋亡相關蛋白的影響

NF-κB是一類具有多向轉錄調節作用的核蛋白因子，在細胞胞漿內是以無活性形式存在，通過I-B激酶（IK）激活后，受抑制的NF-κB得以釋放，發生核移位，在核內積累并與特異性的B序列相結合啟動轉錄。核轉錄因子NF-κB的下調，可促使與抗凋亡相關的NF-κB靶基因如TNF受體相關因子1等表達減弱，從而促進凋亡。NF-κB也可調控Bcl-2家族中兩個抗凋亡蛋白：Bfl-1/A1、Bcl-X1的表達，也誘導Bcl-2和抑制Bax基因表達[16-17]。而Bcl-2與Bax這兩種蛋白參與構成線粒體通路，分別具有抑制和促進細胞凋亡的作用，Bax/Bcl-2蛋白比值決定了細胞的生存和死亡。凋亡通路相關蛋白Bcl-2/Bax/caspase 3被激活，Bax/Cleaved-caspase 3蛋白表達增加，而Bcl-2蛋白被抑制，是經典的線粒體凋亡途徑[18]。

EOK 對 B16-F10 細胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表達的影響結果見圖5。

圖5 EOK 對 B16-F10 細胞 NF-κB（P-P65）、NF-κB（P65）蛋白表達的影響Fig.5 Effect of EOK on NF-κB（P-P65）and NF-κB（P65）protein expression in B16-F10 cells

從圖5中可以看出，與對照組相比，隨著黃皮果果核揮發油濃度的增加，NF-κB（P-P65）與 NF-κB（P65）蛋白表達均下調，其中在濃度0.2 μL/mL作用下蛋白表達量有所減少（P＜0.01）；且對 NF-κB（P65）蛋白表達的抑制作用比對NF-κB（P-P65）蛋白表達的抑制作用更為明顯。同時檢測Bcl-2和Bax蛋白的表達情況，結果如圖6所示。

圖6 EOK對B16-F10細胞Bax、Bcl-2蛋白表達的影響Fig.6 Effect of EOK on Bax and Bcl-2 protein expression in B16-F10 cells

與對照組相比，隨著果核揮發油濃度的增大，Bax蛋白表達增多，其中0.4、0.8 μL/mL組尤為明顯（P＜0.05或 P＜0.01）；而 Bcl-2 蛋白表達在 0.8 μL/mL 組減少尤為明顯（P＜0.01）。通過統計，Bax/Bcl-2的比值增大，0.4、0.8 μL/mL組與對照組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。

對B16-F1細胞Cleaved-caspase 3蛋白表達的影響結果見圖7。

圖7 EOK對B16-F10細胞Cleaved-caspase 3蛋白表達的影響Fig.7 Effect of EOK on Cleaved-caspase 3 protein expression in B16-F10 cells

如圖7所示，黃皮果果核揮發油也能上調Cleaved-caspase 3蛋白的表達。與對照組相比，0.4、0.8 μL/mL 組差異有統計學意義（P＜0.01）。這些結果表明，線粒體途徑參與黃皮果果核揮發油誘導B16-F10細胞的凋亡，其機制可能與抑制胞內NF-кB P65蛋白表達，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號通路有關。

3 結論

水蒸氣蒸餾法提取的黃皮果核揮發油作用于小鼠黑色素瘤B16-F10細胞后，MTT法測定藥物濃度≥0.2 μL/mL時，黃皮果核揮發油對B16-F10細胞增殖有明顯的抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色結果表明，在黃皮果核揮發油作用24 h后，0.8 μL/mL組凋亡細胞的比例高達36.06%。在羅丹明123染色檢測黃皮果核揮發油對B16-F10細胞線粒體膜電位有顯著影響，且隨著藥物濃度增大，熒光強度增強。蛋白免疫印跡結果表明，黃皮果核揮發油能下調NF-κB（PP65）、NF-κB（P65）、Bcl-2 的表達，同時上調 Bax、Cleaved-caspase 3的表達。因此，試驗結果表明：黃皮果果核揮發油以誘導細胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細胞增殖，其機制與抑制胞內NF-кB P65蛋白表達，降低其磷酸化水平，激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號通路有關。