乳酸菌及其組合發酵蘆筍的條件優化

許志美，馬雁，印伯星，魯茂林，桑建，黃玉軍，關成冉，顧瑞霞，*

（1.揚州大學江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室，江蘇揚州225127；2.江蘇省乳業生物工程技術研究中心，江蘇揚州225127）

蘆筍屬于百合科天門冬屬多年生草本植物，含有多種營養元素、人體必須氨基酸和礦物質，同時富含黃酮類等多種生物活性成分，具有抗腫瘤、抗突變、抗衰老、降血脂、免疫調節等生物功能[1]，在當今社會越來越受到人們的關注和喜愛。但蘆筍作為一種季節性蔬菜，種植范圍非常受季節和地域的限制，不易在冬季和部分地區被人購買食用，并且，蘆筍儲存時間一旦過長，不僅營養物質大量流失，還會產生亞硝酸鹽等有毒有害物質。

近年來，關于蘆筍深加工研究的報道眾多，如蘆筍茶、蘆筍酸奶、蘆筍飲料和蘆筍酒等方便食品[2-5]，利用蘆筍提取物開發的蘆筍口服液、蘆筍沖劑、蘆筍膠囊等保健品陸續上市[6]，然而，關于蘆筍發酵蔬菜類產品的報道卻很少。乳酸菌是一群能發酵碳水化合物并產生大量乳酸的益生菌，乳酸菌發酵蔬菜是降低亞硝酸鹽、提高安全性以及增加營養成分的一種有效方法[7]。

本文采用不同乳酸菌及其組合發酵綠蘆筍，以自然發酵為對照，通過比較蘆筍發酵過程中各成分的動態變化，選擇適用蘆筍發酵的最佳乳酸菌及最佳發酵時間，為發酵蘆筍產品制作提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠蘆筍：市售；發酵乳桿菌Xd（Lactobacillus fermentum Xd）、植物乳桿菌5-7-3（Lactobacillus plantarum 5-7-3）：從傳統酸菜中分離獲得，由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室菌種庫保藏；德氏乳桿菌保加利亞亞種Y430（Lactobacillus delbrueckii subsp.Bulgaricus Y430）、副干酪乳桿菌 Yd（Lactobacillus paracasei Yd）：從乳制品中分離獲得，由江蘇省乳品生物技術與安全控制重點實驗室菌種庫保藏；乙醇、草酸、2，6-二氯靛酚、亞鐵氰化鉀、冰醋酸、乙酸鋅、四水硼酸鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸、鹽酸乙二胺、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、硝酸鋁：均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；抗壞血酸標品、蘆丁標品：純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司；MRS液體培養基：青島海博生物技術有限公司。

1.2 儀器與設備

JF-SX-500全自動滅菌鍋：日本TOMY公司；ZHJH-C1209B超凈工作臺：上海智城分析儀器制造有限公司；FIS#13-636 XL25型 pH 計：Fisher Scientific；Millipore Direct8超純水儀：美國Millipore公司；SPX-150BS-1I生化培養箱：上海新苗醫療器械制造有限公司；Bio-Tck ELX800酶標儀：美國寶特公司；5804R型高速冷凍離心機：美國賽默飛世爾科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化

在無菌條件下，將凍干保存的4株乳酸菌Xd、5-7-3、Y430、Yd按5%的接種量接種到MRS液體培養基中，混勻后置于37℃培養箱培養24 h，作為1代菌，同樣操作重復兩次，活化至3代菌，待用。

1.3.2 蘆筍發酵工藝流程

參考蓮藕發酵方法并適當調整[8]。

新鮮綠蘆筍→切除根部→清洗→切段（5 cm～6 cm長）→95℃熱水中漂燙處理3 min→瀝干→添加配料（20 g/kg鹽和40 g/kg糖）→接菌（5 g/100 g乳酸菌菌液）→密封置于30℃暗處發酵→于蘆筍發酵的第0、2、4、6、8、10、12 天各取 100 g蘆筍樣品，以用于營養功能指標檢測。

1.4 檢測指標

1.4.1 pH值的測定

蘆筍樣品與去離子水1∶1（g/mL）混合制成蘆筍勻漿，稱取10.00 g蘆筍勻漿離心，用pH計直接測定上清液pH值，即為蘆筍樣品pH值。

1.4.2 總酸的測定

采用直接滴定法[9]，稱取10.00g蘆筍勻漿，加80 mL去離子水，沸水浴加熱30 min，使有機酸全部溶出，冷卻后加水定容至250 mL，4 500 r/min離心10 min，得上清液。稱取25 g上清液，加40 mL去離子水，滴加2滴酚酞溶液（0.2 mol/L），用 NaOH 溶液（0.01 mol/L）滴定至溶液變成粉紅色且30 s不褪色，記錄消耗的NaOH溶液體積，計算出總酸含量。同時用去離子水代替樣品做空白試驗。

1.4.3 抗壞血酸的測定

采用2，6-二氯靛酚滴定法[10]。稱取10.00 g蘆筍勻漿，用草酸溶液（20 g/L）定容至 100 mL，4 500 r/min離心10 min，得上清液。吸取10 mL上清液，用標定過的2，6-二氯靛酚溶液（0.2 mg/mL）滴定至變成粉紅色且30 s不褪色，記錄消耗的2，6-二氯靛酚溶液體積，計算出抗壞血酸含量。同時用去離子水代替樣品做空白試驗。

1.4.4 黃酮的測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁顯色法[11]，略作修改。蘆丁標準曲線繪制：分別吸取 0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL蘆丁標準溶液（0.1 mg/mL），用去離子水補至1 mL，加1 mL 的 NaNO2溶液（0.05 g/mL），混勻后靜置 6 min，加1 mL的Al（NO3）3溶液（0.1 g/mL），混勻后靜置6 min，加3 mL的NaOH溶液（0.04 g/mL），混勻后靜置15 min，于波長510 nm處測定OD值。以蘆丁含量（mg）為x，510nm處的OD值為y，繪制蘆丁標準曲線。樣品測定：稱取5.00 g蘆筍勻漿，加50 mL 70%乙醇溶液，50℃超聲波輔助提取30 min，4 500 r/min離心10 min，得上清液。取1 mL上清液，按照蘆丁標準曲線測定方法進行操作，根據蘆丁標準曲線計算出黃酮含量。同時用去離子水代替樣品做空白試驗。

1.4.5 亞硝酸鹽的測定

采用鹽酸萘乙二胺法[12]。亞硝酸鈉標準曲線繪制：吸取 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.50、2.00、2.50 mL亞硝酸鈉標準使用液（5.0 μg/mL），加2 mL對氨基苯磺酸溶液（4 g/L），混勻，靜置5 min，加1 mL鹽酸萘乙二胺溶液（2 g/L），定容至 50 mL，混勻，靜置 15 min，于波長538 nm處測OD值，以蘆丁含量（mg）為x，538 nm處的OD值為y，繪制亞硝酸鈉標準曲線。樣品測定：稱取5.00 g蘆筍勻漿，加12.5 mL飽和硼砂溶液（50 g/L），攪拌均勻，加300 mL去離子水，沸水浴加熱15 min，冷卻，加5 mL亞鐵氰化鉀溶液（106 g/L），勻，加5 mL乙酸鋅溶液（220g/L），定容至500 mL，搖勻后放置30 min，4 500 r/min離心10 min，得上清液。吸取40.0 mL上清液，按照亞硝酸鈉標準曲線測定方法測定，根據亞硝酸鹽標準曲線，計算出亞硝酸鹽含量。同時用去離子水代替樣品做空白試驗。

1.5 數據處理與統計分析

所有試驗均重復3次，采用Microsoft Excel 2016整理試驗數據，采用IBM SPSS Statistics 22統計分析試驗數據，采用OriginPro 2017繪圖。結果以均值±標準差（Mean±SD）表示，不同處理間比較采用單因素方差分析，多重比較采用Duncan法，當P＜0.05時，判定為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中pH值的變化

pH值是判別發酵程度的重要因素，一般來說，發酵蔬菜成熟時的pH值為3.5左右，此時風味最佳[13]。用4株乳酸菌（發酵乳桿菌Xd、植物乳桿菌5-7-3、德氏乳桿菌保加利亞亞種Y430、副干酪乳桿菌Yd）及其6 種雙菌株組合（Yd+Xd、Yd+Y430、Yd+5-7-3、Xd+Y430、Xd+5-7-3、Y430+5-7-3）在 30 ℃條件下發酵蘆筍12 d，每2 d測定發酵蘆筍的pH值，其pH值變化情況如圖1所示。

圖1 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中pH值的變化Fig.1 Changes of pH value during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖1可知，蘆筍pH值隨著發酵時間的延長出現下降趨勢。自然發酵蘆筍的pH值緩慢下降，其pH值從6.55下降至4.24。乳酸菌發酵蘆筍的pH值快速下降，在發酵前8 d，pH值快速從6.55下降至3.44，此時乳酸菌發酵蘆筍已經開始成熟，在發酵8 d～12 d，pH值趨于穩定，其范圍為3.19～3.44。不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍之間的pH值無顯著性差異（P＞0.05）。

2.2 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中總酸的變化

總酸是判別發酵程度的另一個重要因素，發酵蔬菜的最適總酸范圍為6 g/kg～8 g/kg，此時口感最佳[13]。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發酵蘆筍12 d的總酸含量變化情況如圖2所示。

圖2 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中總酸的變化Fig.2 Changes of total acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖2可知，發酵蘆筍的總酸含量在發酵前期快速上升，而在發酵后期，其總酸含量趨于穩定。自然發酵蘆筍的總酸含量上升最緩慢，在發酵12 d期間，從0.84 g/kg增加到4.54 g/kg，酸度不足，發酵蘆筍不能達到最佳口感。除了Yd發酵蘆筍外，乳酸菌發酵蘆筍的總酸在發酵8 d～12 d期間趨于穩定，其總酸含量處于6 g/kg～8 g/kg，此時發酵蘆筍口感最佳。乳酸菌發酵蘆筍在發酵8 d時均已經開始成熟。而Yd發酵蘆筍的總酸含量在發酵后期仍快速增加，在發酵10 d時為8.48 g/kg（＞8 g/kg），口感已經不是最佳。

2.3 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中抗壞血酸的變化

抗壞血酸是蘆筍中含量較高的維生素，是一種高效抗氧化劑，其含量影響蘆筍的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發酵蘆筍12 d的抗壞血酸含量變化情況如圖3所示。

圖3 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中抗壞血酸的變化Fig.3 Changes of ascorbic acid during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖3可知，在整個發酵期間，發酵蘆筍中的抗壞血酸含量均呈現下降趨勢。其可能是原料中的抗壞血酸滲透到發酵液中而流失或被氧化而減少[14]，這與白菜發酵過程的抗壞血酸含量研究[15]和辣椒腌制過程的抗壞血酸含量研究的結果一致[16]。自然發酵的抗壞血酸含量下降最快，從18.17 mg/100 g下降至6.03 mg/100 g。乳酸菌發酵蘆筍的抗壞血酸含量始終高于自然發酵。Y430發酵蘆筍的抗壞血酸含量最高，在發酵12 d時仍保留11.35 mg/100 g，Yd+Y430發酵蘆筍的抗壞血酸含量僅低于Y430發酵組，在所有乳酸菌組合發酵蘆筍中最高，在發酵12 d時，其抗壞血酸含量為10.28 mg/100 g。

2.4 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中黃酮的變化

黃酮是一種功能性很強的抗氧化劑，其含量同樣影響蘆筍的抗氧化能力。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發酵蘆筍12 d的黃酮含量變化情況如圖4所示。

由圖4可知，自然發酵蘆筍的黃酮含量在發酵前8 d一直低于乳酸菌發酵組，其在發酵0～2 d下降至7.499 mg/100 g，在發酵 2 d～8 d 上升至 3.668 mg/100 g，在發酵8 d～12 d保持穩定。乳酸菌發酵蘆筍的黃酮含量在整個發酵期間均呈現先上升后下降趨勢，其在發酵8 d時達到最大值，Y430和Yd+Y430發酵蘆筍的黃酮含量明顯高于其他發酵組，分別為63.174 mg/100 g和56.622 mg/100 g。在發酵前期，可能是乳酸菌發酵能夠產生多種酶，促進黃酮合成[17]。在發酵后期，可能是發酵產酸導致強酸環境，黃酮在強酸環境中不穩定而被分解[18]。

圖4 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中黃酮的變化Fig.4 Changes of flavonoids during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

2.5 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中亞硝酸鹽的變化

亞硝酸鹽是一種強毒性物質，可與仲胺反應生成致癌物亞硝胺[8]。在食品安全國家標準中，蔬菜及其制品和腌漬蔬菜的亞硝酸鹽限量為20 mg/kg[19]。用4株乳酸菌及其6種雙菌株組合在30℃條件下發酵蘆筍12 d的亞硝酸鹽含量變化情況如圖5所示。

圖5 不同乳酸菌及其組合發酵蘆筍過程中亞硝酸鹽的變化Fig.5 Changes of nitrite during fermentation of asparagus by different Lactobacillus and their combinations

由圖5可知，最初蘆筍原料的亞硝酸鹽含量很低，只有1.34 mg/kg，在整個發酵期間，發酵蘆筍的亞硝酸鹽含量呈先上升后下降趨勢，出現亞硝峰，這可能是植物中存在的硝酸還原酶所致[20-21]。自然發酵蘆筍在發酵6 d時出現亞硝峰，其峰值為46.32 mg/kg，發酵6 d后，其亞硝酸鹽含量一直維持較高水平，在發酵12 d時為39.33 mg/kg。乳酸菌發酵蘆筍的亞硝酸鹽含量在整個發酵期間明顯低于自然發酵，在發酵8 d時，乳酸菌發酵蘆筍的亞硝酸鹽均低于20 mg/kg，達到食用安全期。Yd+Y430和Xd+Y430發酵蘆筍的亞硝峰提前出現在發酵4 d時，其亞硝酸鹽峰值分別為21.80 mg/kg和20.20 mg/kg，其食用安全期也提前至發酵6 d，此時其亞硝酸鹽含量分別為16.36 mg/kg和17.27 mg/kg（＜20 mg/kg）；Y430和Y430+5-7-3發酵蘆筍的亞硝酸鹽峰值分別為19.33 mg/kg和10.61 mg/kg（＜20 mg/kg），一直處于在食品安全國家標準的亞硝酸鹽限量內，所以Y430和Y430+5-7-3發酵蘆筍無亞硝酸鹽危害。

3 討論

乳酸菌發酵蔬菜有利于改善風味，抑制雜菌生長，提高產品安全性[13]。本文采用4株乳酸菌及其6種雙菌組合發酵綠蘆筍，從產酸能力來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有迅速發酵能力，使pH值快速降低而總酸含量快速升高，使產品快速達到風味最佳時要求的外部條件，同時，后期的酸性環境也可抑制雜菌的生長。乳酸菌發酵蘆筍的pH值和總酸含量在發酵8 d～12 d期間趨于穩定，這可能是乳酸菌在前期快速生長產生大量乳酸而在后期受到強酸環境抑制而減少甚至停止產酸[6，23]。

從營養與功能成分來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有改善營養與功能成分能力，乳酸菌發酵蘆筍中抗壞血酸和黃酮含量均高于自然發酵蘆筍，有利于增強發酵蘆筍的抗氧化性。Y430和Yd+Y430發酵蘆筍的抗壞血酸含量和黃酮峰值含量明顯高于其他乳酸菌及其雙菌組合發酵。這表明Y430和Yd+Y430對抗壞血酸的抑制作用和對黃酮合成的促進作用最強。

從安全性來看，4株乳酸菌和6種雙菌組合均具有降解亞硝酸鹽能力，乳酸菌發酵蘆筍的亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵，有利于提高發酵蘆筍的安全性。乳酸菌降解亞硝酸鹽機理主要是酶降解和酸降解兩種[24]。乳酸菌生長代謝能夠產生亞硝酸鹽還原酶，促使亞硝酸鹽進行酶降解[25]。乳酸菌快速產酸，促使亞硝酸鹽進行酸降解[26]。另外，與其他菌株發酵相比，Y430和Yd+Y430發酵蘆筍中亞硝酸鹽含量也較低，這可能是因其抗壞血酸和高酮含量較高，具有還原性的抗壞血酸和黃酮也能夠降解亞硝酸鹽[27-28]。

4 結論

本文采用4株乳酸菌及其6種雙菌組合發酵綠蘆筍，結果顯示：乳酸菌發酵蘆筍的產酸能力、降解亞硝酸鹽能力、抗壞血酸和黃酮含量均高于自然發酵，其中Y430和Yd+Y430分別是蘆筍發酵的最佳單菌和最佳雙菌組合，蘆筍發酵的最佳時間為8 d。為人工接種發酵蘆筍運用到工業化生產中提供一定的理論依據。