紫小麥麩皮花色苷提取及應用研究

楊三維，李劉軍，喬 玲，趙佳佳，鄭興衛，葛 川，蘆艷珍，田 鵬

（1山西省農業科學院小麥研究所，山西臨汾041000；2山西大學商務學院體育系，太原030006）

0 引言

當前食品和飲料等行業多使用合成色素作為著色劑，合成色素往往具有致癌、致突變等副作用，易對人體健康產生不良影響[1]。天然色素除可作為著色劑使用外，還具有營養價值和藥理作用。隨著人們不斷追求健康、天然和高品質的生活質量，天然色素必將取代化學合成色素?；ㄉ兆鳛橐环N安全、無毒的天然色素，對人體具有多種保健功能，常用于清除體內自由基、增殖葉黃素，具有抗腫瘤、抗癌、抗炎、抑制脂質過氧化和血小板凝集等作用[2-3]。目前植物花色苷的提取多以新鮮植物為原料，受季節影響很大，已有從藍莓、桑葚、葡萄皮、黑加侖和紫薯等植物中提取花色苷方法的報道，提取出的花色苷應用于食品、化妝品、醫藥、工業等領域，體現出較大的應用潛力[5-7]。植物花色苷的提取方法多采用酸堿溶液分步提取法，存在提取率低、活性差的缺點，酸堿液對后續的純化設備損害也比較大。此外，這些方法提取出的花色苷雜質較多，其中的多糖、蛋白和淀粉容易對人產生過敏等影響。也有利用超聲波和復合酶等方法提取花色苷的報道[8-9]，具有周期短、得率高的特點，但尚未應用于實際生產。因此，尋找、開發新的植物花色苷來源以及高純度的提取方法具有重要意義。

紫小麥是一種理想的天然食品資源，紫小麥種皮富含天然花色苷類化合物而呈現紫色，其紫粒特性是由長穗偃麥草和四倍體與小麥的遠緣雜交而來，不同來源紫小麥所含有的紫色素成分不同[10]。關于紫小麥花色苷的提取已有報道，傅虹飛等[11]和蔣彥婕等[8]研究了紫小麥花色苷超聲波輔助提取工藝，李偉等[12]利用酸化乙醇法提取麩皮中花色苷的工藝。與紫薯和藍莓等其他植物相比，小麥花色苷的提取率偏低，所用紫麥品種不明確也導致其花色苷種類未知，這些因素限制了小麥花色苷的進一步開發和應用。因此，尋找、挖掘穩定的紫麥花色苷來源以及高純度的提取方法一直倍受重視。為提升紫小麥綜合利用價值，本文提供了一種高純度、低成本的花色苷提取工藝，研究了小麥花色苷的抗氧化和染毛特性，以期為紫小麥花色苷的進一步應用開發提供新方法和新材料。

1 材料與方法

1.1 供試材料

當前推廣面積較大的紫小麥品種‘農大3753’，由山西省農科院小麥研究所保存。

1.2 原料預處理

收集出粉率為75%左右的紫小麥麩皮，麩皮主要成分為種皮、胚和少量胚乳，將麩皮用麥麩粉碎機（WFJ-15，佳科機械制造有限公司）粉碎至200目后貯藏備用。

1.3 花色苷提取工藝

CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）浸提液配方為：十六烷基三甲基溴化銨23 g，乙二胺四乙酸二鈉3 g，蔗糖5 g，檸檬酸6 g，定容至1 L；所用試劑均為國產分析純（北京化工廠），試驗過程參考文獻[13]進行，增加脫蛋白和去多糖等步驟。

1.4 小麥花色苷的提取工藝優化

以料液比、提取次數和提取時間為自變量，單因素試驗優化紫小麥花色苷提取的最優工藝參數。

1.5 花色苷的含量和色價測定

參考文獻[14]，采用pH值示差法測定花色苷含量，具體步驟為：取pH 1.0氯化鉀-鹽酸緩沖液和pH 4.5醋酸鈉緩沖液各9 mL，加入待測樣品1 mL混勻后，利用紫外-可見分光光度計（日立U-2010型）檢測。根據式(1)計算花色苷含量。式(2)用于起始標量的計算。

式中，V為提取總體積，n為稀釋倍數，449為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾質量(g/mol)，26900為矢車菊色素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(L·mol/cm)，m為樣品質量(g)。

通過520 nm的吸光值測定花色苷色價值，具體方法為：稱取1 g花色苷粉末，用pH 3.0的檸檬酸緩沖液溶解并定容至100 mL，再進行適當稀釋使吸光值在0.2～0.8，緩沖液作對照，計算如式(3)，式中，%表示試樣濃度為1%的色價。

1.6 花色苷成品標準檢測

采用電感耦合等離子體原子發射光譜儀（法國JY138）和原子吸收光譜儀（日立-Z5000）檢測提取物金屬含量。元素標準溶液(100 μg/mL)由國家標準溶液(NCS)稀釋而成，試驗用水為去離子水。ICP分析條件：譜線波長As為193.7 nm，工作功率1250 W，入射狹縫18 nm，出射狹縫79 nm，進樣速率1.5 mL/min，載氣壓力0.25 MPa，護套氣量0.18 L/min，冷卻氣流量18 L/min。原子吸收分析條件：燈電流7.5 mA，狹縫1.3 nm，燃燒器高度7.5 mm，火焰類型為貧燃。提取物中金屬總含量通過比色法測定，按照國家標準《有機化工產品中重金屬的測定》編號GB/T 7532—2008進行。

1.7 花色苷抗氧化活性檢測

在含有H2O2魯米諾發光體系中檢測不同濃度小麥花色苷的清除活性氧的IC50，在測定瓶中依次加入100 μL濃度為5 mol/L的H2O2和0.2 mol/L pH 9.7的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液500 μL，再加入不同濃度的供試樣品，蒸餾水作為空白對照；混合均勻后加入5 mol/L的魯米諾和10 mol/L的CTMAB（十六烷基三甲基溴化銨）等量混合液500 μL啟動反應，將樣品置于液閃測定儀中，延時10 s，測定12 s內的發光強度。

1.8 紫小麥花色苷羊毛染色

將羊毛放入Na2CO3溶液中浸泡，可以促使染料分子與毛發蛋白結合；再用金屬鹽作為媒染劑與花色苷分子顯色，并固定染料分子；最后將花色苷與金屬離子作用顯色并固定，從而使羊毛著色。具體方法為：先將洗凈的白色羊毛放入Na2CO3預處理液中10 min，在金屬離子媒染劑中處理10 min后洗凈，最后放入3%花色苷溶液中染色10 min，觀察其顏色的變化。

2 結果與分析

2.1 花色苷提取工藝

在對紫小麥麥麩進行充分粉碎的條件下，采用改良CTAB法在室溫下提取花色苷，同時使用pH值沉淀和有機溶劑沉淀去除蛋白和多糖等雜質。具體工藝為：（1）取粉碎后的麥麩0.5 kg，按照一定(m/v)比例使用CTAB液浸提，12000 g離心10 min，取上清。（2）使用HCl將離心后上清液調至pH 4.2，10000 g離心15 min，棄沉淀。（3）用NaOH將上清液調節至pH 8.0，10000 g離心15 min。（4）旋轉蒸發器將以上提取液濃縮至0.25 L后，再加入2倍體積99%的乙醇去除多糖，12000 g離心10 min棄沉淀。（5）大孔吸附樹脂(AB-8)吸附色素后，20%～30%的乙醇洗脫雜質，再用60%的乙醇解吸樹脂中吸附的色素。（6）使用耐乙醇的有機鈉濾膜對解吸液進行濃縮，得到濃度10%左右的濃縮液。（7）采用旋轉蒸發器進一步濃縮樣品至100 mL左右，12000 g離心10 min，去除雜質和不溶絡合物。（8）設定干燥器進風溫度為160℃，出風溫度為75℃，噴霧干燥得到花色苷成品。

2.2 小麥花色苷的提取方法優化

已有文獻研究表明，提取次數、提取溫度、提取時間和料液比是影響小麥花色苷提率的主要因素[9,11-12]。為了保持花色苷穩定性，在室溫條件下優化小麥花色苷的提取方法，以提取次數、提取時間和料液比為自變量，提取量為響應值進行單因素試驗。試驗結果表明，隨著提取時間的增加，花色苷的提取率提高，當提取時間超過60 min后花色苷提取率則出現下降趨勢（圖1A）。原因可能是提取時間過長，使得組織中大量的細胞破裂，細胞內大量不溶物及黏性物質等混入到提取液中，導致溶液中雜質增多，黏度增大，影響了花色苷的溶出；另一方面隨著提取時間的延長，花色苷的多糖分子鏈斷裂，在醇沉處理過程中損失增大，從而降低了花色苷的提取率，由此，確定花色苷的最佳提取時間為60 min（圖1B）。將麥麩粉以不同比例加提取液進行提取，隨著提取液用量的不斷增大，花色苷提取率明顯提高，原因可能是溶劑比例的增加可有效降低溶液的黏度，提高了濃度差，有利于花色苷分子擴散（圖1C），確定花色苷提取的料液比為1:3為宜。以料液比為1:3，提取時間60 min條件下，研究了提取次數對花色苷提取率的影響，從圖1A中可以看出，隨著提取次數增多，花色苷的得率增加，但超過3次以后，提取率降低。因此，根據單因素確定的最佳提取參數，采用提取次數為3次、提取時間為60 min和料液比為1:3.2在室溫下進行小麥花色苷提取，花色苷的得率為3.20 g/kg。

2.3 紫小麥花色苷紫外光譜分析

從圖2中可以看出，提取出的花色苷樣品只在520～540 nm處有較強的花色苷吸收峰出現，310～355 nm處花青素?；Y構的特征峰峰位沒有出現，表明花色苷純度較高；280 nm處蛋白質吸收峰較低，說明采用pH值沉淀法有效脫除了蛋白?；ㄉ諡樘桥潴w，分子量較大，導致提取物中含有大量的多糖、蛋白和淀粉，極大地限制了花色苷的應用，而用本工藝提取的花色苷雜質少、純度較高。

2.4 花色苷成品標準檢測

為進一步明確提取出的花色苷中金屬含量等相關指標，采用比色法測定總金屬含量，原子吸收光譜儀和離子體原子發射光譜儀測定鉛和砷等物質的含量。從表1可以看出，提取的花色苷其色價為170，其中，重金屬總含量小于29 μg/g，遠低于國家標準；鉛和砷等毒性較大的金屬離子均未檢出；干燥失重后僅為4.6%，灰分成分為2.4%，2項指標均達到了商業化標準[20]。

圖1 不同條件對花色苷提取率的影響

圖2 花色苷提取的紫外-可見光譜

表1 紫小麥種皮花色苷性質檢測

2.5 花色苷抗氧化性評價

傅虹飛等[11]研究證明小麥花色苷具有較強的清除DPPH自由基和ABTS自由基的能力，但未與相關抗氧化劑進行對比。為明確‘農大3753’紫小麥花色苷的抗氧化特性，在含有H2O2魯米諾發光體系中進行檢測，試驗結果表明，加入的抗氧化劑濃度越高，對活性氧的清除率越高。IC50為抑制氧化發光50%時所需清除劑濃度，以清除百分率對清除劑濃度比較可計算出IC50為1.52。張立偉等[14]發現連翹活性物對活性氧具有較強的清除能力，對H2O2清除能力IC50為1.618，相同濃度的條件下，小麥花色苷具有較強的清除H2O2的能力。

2.6 小麥花色苷羊毛染色

小麥花色苷應用研究開展較少，未見用于毛發染色的有關報道。本工藝提取的紫小麥花色苷具有較高的純度和色價，因此，進行了羊毛染色的相關試驗。從圖3看出，花色苷與不同金屬元素作用可將羊毛染成不同顏色，MgSO4-花色苷顯紫紅色，FeSO4-花色苷顯土黃色，AlCl3-花色苷顯棕色，FeCl3-花色苷顯藍紫色。

3 討論

近年來，國內紫小麥的種植面積不斷增加，‘農大3753’、‘寧春46’和‘河東烏麥’已有穩定種植面積[15]。紫小麥的開發大多以面粉為主，富含花色苷的麥麩產量大，但利用率卻很低，大部分用作動物飼料，造成了原料的廉價消耗。當前，小麥花色苷的提取多采用酸堿抽提，劉慧芳等[15]采用酸化乙醇浸提法提取的紫小麥花色苷得率為(0.87±0.21)g/kg；也有利用超聲波和高溫提取的報道[16-17]，如傅虹飛等[11]采用超聲波輔助提取得到小麥花色苷得率為(1.82±0.23)g/kg，是普通浸提法的2倍。由于麥麩中含有較多的淀粉和蛋白，加之酸堿裂解，導致提取出的花色苷活性較低，極大地限制了小麥花色苷的開發和利用。CTAB法目前主要用于植物DNA的提取，是一種較為溫和高效的植物破除細胞壁的方法，目前尚未見利用CTAB法提取植物色素的研究報道。筆者改良CTAB法后用于提取小麥麩皮中的花色苷，紫小麥花色苷得率為3.20 g/kg，高于前2種方法。此外，在提取過程中添加了去多糖和淀粉的步驟大大提高花色苷的純度，為小麥花色苷的進一步利用奠定了基礎。

圖3 花色苷羊毛染色樣品.

在抗氧化方面，張立偉等[14]發現連翹活性物對活性氧具有較強的清除能力，筆者提取的花色苷對H2O2清除能力高于連翹皂甙。此外，金屬元素分析研究表明，CTAB法提取出的花色苷重金屬含量很低，達到了國家食品藥品的相關標準?？梢娮闲←滬熎せㄉ盏捏w外抗氧化活性高，在抗氧化功能性食品或功能因子添加劑方面具有較大的開發應用價值。毛發染色已成為美妝領域最流行的產品，目前全球染發需求市場年平均增長約5%，在未來仍將不斷增長[18-19]。目前永久型染發劑的染料中間體一般采用具有毒性的苯二胺及其衍生物[20-22]，因此，隨著人類健康意識的增強和科技的進步，有毒染料會逐漸退出市場。法國、英國等歐洲國家已研制出蘇木精為原料的植物染發劑，日本也有市售的辣椒素、單寧酸、胭脂紅酸等植物天然毛發染色劑[19,23-24]。在中國歷來就有利用何首烏、蘇木精和胡桃醌等天然色素進行染發的傳統[25]，均是基于花色苷可與多種金屬元素結合顯色的原理。因此，筆者采用與人類頭發組織結構相似的羊毛為原料，通過不同金屬元素與花色苷結合進行羊毛染色，初步結果表明小麥花色苷作為染發劑的可行性和著色穩定性，這些結果進一步拓寬了小麥花色苷的應用和研究范圍。