血漿種類和溫度對褶紋冠蚌鉤介幼蟲非寄生變態發育及早期稚蚌生長的影響

馬學艷，聞海波，金 武，華 丹，徐 跑,3，顧若波,3

（1中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，農業部淡水魚類遺傳育種與養殖生物學重點開放實驗室，江蘇無錫214081；2中國水產科學研究院淡水漁業研究中心，中美淡水貝類種質資源保護及利用國際聯合實驗室，江蘇無錫214081；3南京農業大學，無錫漁業學院，江蘇無錫214081）

0 引言

在自然界，絕大多數的蚌類需要寄生到寄主上（主要是魚）才能完成變態發育[1-2]。有的蚌有多種寄主魚，如Anodonta anatina[3]，有的蚌只能寄生一種魚，如Alasmidonta mino[4]。體外培養是不經過魚體寄生過程使鉤介幼蟲變態成為稚蚌的技術。目前，已知宿主魚信息的淡水蚌類僅占1/4[5]，體外培養技術對蚌類繁育保護，尤其對寄主魚瀕危和未知淡水蚌類的人工繁殖具有重要作用。

利用體外培養技術已成功培養41個蚌類，其中有18種可以利用動物血清完成變態發育[5]。Isom等[6-7]最早創建了鉤介幼蟲體外培養技術，通過添加魚血清，首次成功獲得了幾種非寄生變態發育的稚蚌，證明血清是蚌科鉤介幼蟲變態發育的關鍵物質。Uthaiwan等[8]測試了4種魚和馬血清對Hyriopsis myersiana鉤介幼蟲生長發育的影響，表明血清種類對鉤介幼蟲變態率及稚蚌早期成活率影響顯著。馬學艷[9]比較了寄主魚與非寄主魚血漿對褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態發育的影響，結果表明非寄主魚血清對鉤介幼蟲的變態發育及變態稚蚌的生長無顯著影響。而動物血清是否能代替魚血清在體外培養技術中為褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態發育提供營養因子有待于進一步研究。

蚌類按繁殖類型可以分為兩類[4]：第一類為長期發育類型，多秋季交配，寄生繁育期水溫較低，如褶紋冠蚌(C.plicata)[10]、絹絲麗蚌(Lamprotula fibrosa)[11]；第二類為短期孵育類型，多在春末和夏季排放幼蟲，寄生繁育期水溫較高，如三角帆蚌(H.cumingii)[12]。不同繁育類型的蚌類幼蟲變態發育的溫度存在較大差異。而在經典的體外培養技術中，培養溫度一般設定為23～25℃[8,13-15]。Roberts和Barnhart[16]測試了溫度對淡水蚌A.suborbiculat鉤介幼蟲的變態發育影響，證實溫度影響其變態率。體外培養溫度對褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態率是否有影響有待評估。

褶紋冠蚌隸屬蚌科(Unionidae)、無齒蚌亞科(Anodontinae)，為大型雙殼類，生長快，凈水能力強，是中國重要的淡水經濟之一，也是湖泊增殖放流的主要淡水蚌類，具有較高的經濟價值和生態價值。本研究比較3個培養溫度對鉤介幼蟲的變態發育影響，對其生物學零度和有效積溫進行了估算，同時測試了特定寄主魚—鳙魚(Aristichthys nobilis)血漿及2種商用動物血清對鉤介幼蟲變態率的影響；進一步比較了養殖水溫對變態稚蚌早期成活和生長影響。本研究結果將進一步完善淡水蚌類鉤介幼蟲體外培養技術和理論，為淡水蚌類的增值保護提供技術支撐。

1 材料及方法

1.1 試驗材料

1.1.1 褶紋冠蚌親本采集及成熟鉤介幼蟲獲得 試驗用褶紋冠蚌采自中國水產科學研究院淡水漁業研究中心南泉養殖基地，為4～5齡性成熟母蚌；從10月中旬開始（水溫低于21℃），檢查雌蚌外鰓絲是否有成熟鉤介幼蟲。選取含有成熟鉤介幼蟲的母蚌，在室溫(24±0.5)℃條件下干燥24 h，便于鉤介幼蟲的排出。鉤介幼蟲的成熟判斷標準及獲得方法參照聞海波等[12]方法，鉤介幼蟲的清洗參考Uthaiwan等[13]方法，清洗幼蟲水溫為24±0.5℃。

1.1.2 血清準備 選取體格健壯、外表無傷的鳙魚作為血清采集實驗魚，其體重為(163±17)g。采血前，試驗魚用50～100 mg/L的MS-222（生工生物工程（上海）股份有限公司）麻醉，注射器用2800單位/mL的肝素鈉潤洗，采血方法參考Uthaiwan等[13]方法，血液采集后3000 r/min離心10 min，取上清液；用0.22 μm無菌過濾器過濾，-80℃冰箱保存備用。特級馬血清(E510006)、特級胎牛血清(E600001)購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 血清對鉤介幼蟲體外培養變態率影響

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿、馬血清、胎牛血清作為鉤介幼蟲體外培養的重要營養源，以L-15為基礎培養液（生工生物工程（上海）股份有限公司），基礎培養液、血清、抗生素混合液比例為2:1:0.5，培養液及幼蟲置于無菌培養皿(15×60 mm)中，每盒幼蟲數量300±10只。每組設置5個重復，培養皿置于生化培養箱（上海博迅實業有限公司醫療設備廠），每3天換液一次，共換液3次。抗生素混合液配方：100 μg/mL羧芐青霉素二鈉、100 μg/mL硫酸慶大霉素、100 μg/mL發霉素和5 μg/mL兩性霉素B。鉤介幼蟲變態標準參照Uthaiwan等[13]標準，鉤介幼蟲變態率計算見公式(1)。

1.3 培養溫度對鉤介幼蟲變態率的影響

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿作為鉤介幼蟲體外培養的重要營養源，設置18、24、30℃3個培養溫度，為降低鉤介幼蟲的應激反應，18℃組每天降低2℃，30℃組每天升高2℃，2個溫度組在第3天達到設定溫度。3種溫度條件下培養的鉤介幼蟲均換液3次，其中18℃培養條件下5天換1次，24℃培養條件下3天換1次，30℃條件下2天換1次。其他條件同1.2描述。

1.4 變態發育生物學零度和有效積溫的計算

選用褶紋冠蚌寄主魚—鳙魚血漿作為鉤介幼蟲體外培養的重要營養源，培養鉤介幼蟲3組，每組5個重復，分別放在18、24、30℃下培養，通過預試驗可知三組溫度條件分別從培養第8、5、3天開始統計幼蟲變態率；正常變態發育的鉤介幼蟲，在未完成變態前均為閉合狀，開口狀幼蟲均不能變態發育成稚蚌。統計時，在無菌操作臺中每組每個重復隨機吸取30只，單獨放在培養皿中加入曝氣自來水，進行喚醒。統計閉合鉤介幼蟲的數量，若閉合鉤介幼蟲經喚醒后變態率＞95%，則視為在此溫度下鉤介幼蟲變態發育完成。

根據直線回歸方法，運用公式(2)[17-18]計算有效積溫(K)，公式(3)計算鉤介幼蟲培養溫度。

其中，N為鉤介幼蟲培養時間(d)；T為鉤介幼蟲培養溫度(℃)。

1.5 不同血漿組變態稚蚌的成活與生長評估

取3種血清（血漿）培養的變態成功稚蚌各500只，每組100只，設置5個重復，分別放在塑料箱子(32×21×10 cm)中培育，加熱棒控溫，養殖溫度為24℃，養殖水體為5 L。用充分曝氣自來水養殖，每天添加少量底泥，其中底泥為未施肥的花園土，加入水后過200目篩網，微波爐高溫處理10 min，冷卻后使用。投喂濃縮藻類[19]，使水體藻密度保持在2×106個/mL，每天換水1/2，換水時用200目篩網過濾，確保稚蚌不丟失。培育30天后在光學顯微鏡(Olympus CX41)下拍照、測量幼蚌殼長(0.01 mm)，并統計成活率。

1.6 養殖水溫對早期稚蚌生長的影響

取以鳙魚血漿作為營養源在30、24℃培養的變態成功稚蚌各500只，18℃培養的稚蚌1500只，養殖條件見表1（養殖時若有溫差，每天升高2℃），其他條件同實驗1.5中描述。

1.7 統計分析

采用SPSS 20統計軟件分析實驗數據。采用OnewayANOVA單因素方差分析，多重比較采用最小顯著差數法（LSD法）。在Excel 2010繪制相關圖表。

表1 鉤介幼蟲培養條件及稚蚌養殖條件

2 結果與分析

2.1 血漿對鉤介幼蟲體外培養變態率影響

血漿對鉤介幼蟲體外培養變態率影響如圖1所示，單因素方差分析表明：鳙魚血漿培養的鉤介幼蟲變態率極顯著高于馬血清、牛血清組(P＜0.01)，牛血清組變態率極顯著高于馬血清組(P＜0.01)。

字母不同表示差異顯著(P＜0.05)

2.2 溫度對鉤介幼蟲體外培養變態率影響

溫度對鉤介幼蟲體外培養變態率影響如圖2所示，單因素方差分析表明：18℃培養的鉤介幼蟲變態率均顯著高于30、24℃(P＜0.05)；30℃培養的鉤介幼蟲變態率最低，顯著低于24℃組(P＜0.05)。

2.3 褶紋冠蚌生物學零度和有效積溫

褶紋冠蚌鉤介幼蟲在30、24、18℃條件下，完成變態發育時間分別是5、7、12天，根據T=(1/N)*K+C可得：褶紋冠蚌生物學零度為9.34℃，有效積溫為102.84℃·d。

2.4 不同血清培養對早期稚蚌生長發育的影響

不同血清培養對早期稚蚌生長發育的影響如表2所示，鳙魚血漿培養成功的稚蚌成活率顯著高于牛血清組(P＜0.05)，極顯著高于馬血清組(P＜0.01)，早期稚蚌養殖一個月后，鳙魚血漿組稚蚌殼長顯著高于牛血清組、馬血清組組(P＜0.05)，牛血清組與馬血清組之間稚蚌殼長無顯著性差異(P＞0.05)。

圖2 溫度對鉤介幼蟲體外培養變態率影響

圖3 褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態發育的有效積溫及生物學零度

表2 不同血漿培養對早期稚蚌生長發育的影響

2.5 養殖溫度對早期稚蚌生長發育的影響

A1、A2、A3 為在 30、24、18℃中培養，在 30、24、18℃條件下養殖的稚蚌，單因素方差表明，A3組、A2組成活率極顯著高于A1組(P＜0.01)，且A3組顯著高于A2組(P＜0.05)；A1、A2組稚蚌殼長無顯著性差異P＞0.05)，顯著高于A3組(P＜0.05)。

A3、A4、A5組為18℃條件培養成功變態，在不同溫度養殖的早期稚蚌，A3組成活率顯著高于A4組(P＜0.05)，極顯著高于A5組(P＜0.01)，A4、A5組稚蚌殼長無顯著性差異(P＞0.05)，顯著高于A3組(P＜0.05)。

表3 培養溫度對稚蚌早期的生長發育的影響

3 討論

3.1 血清對鉤介幼蟲變態率及早期稚蚌生長的影響

3.1.1 血清對鉤介幼蟲變態率的影響 Isom和Hudson[7]研究表明，魚血清種類對蚌的培養是沒有影響的。Owen[20]用兔血清和鯉魚血清培養Lampsilis fasciola變態率無顯著性差異，對Utterbackia imbecillis培養時，兔血清和鯉魚血清變態率顯著高于用胎牛血清培養的鉤介幼蟲組，兔血清和鯉魚血清組無顯著性差異。Uthaiwan等[13]用H.myersiana測試了尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)血清和馬血清體外培養的效果，證實魚血清組變態率顯著高于馬血清，用4種魚血清和馬血清在對H.myersiana鉤介幼蟲進行體外培養試驗，用鯉魚(Cyprinus carpio)血清培養的鉤介幼蟲成活率及變態率顯著高于用其他4種血清，以紋鯰魚(Pangasius pangasius)為營養源組變態率最低[8]。本實驗結果表明用魚類血清培養的褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態率顯著高于動物血清培養，這可能是不同蚌類對營養需求不同導致。

3.1.2 血清培養對早期稚蚌成活的影響 Uthaiwan等[8]用4種魚血清和馬血清在對H.myersiana鉤介幼蟲進行體外培養試驗，只有鯉魚血清培養的稚蚌可以存活2個月以上，而尼羅羅非魚(O.niloticus)和雜交鯰魚(Clarias macrocephalus×C.garienus)血清培養鉤介幼蟲只存活1個月，馬血清培養的鉤介幼蟲只存活2～3個星期，條紋鯰魚(P.pangasius)血清培養的稚蚌只存活了1個星期。Reece[21]比較了魚體寄生和利用馬血清體外培養2種方法獲得L.fasciola稚蚌后期生長及存活差異，結果顯示：魚體寄生變態稚蚌生長比體外培養快，1周后魚體寄生稚蚌的成活率為82%，用馬血清作為營養源的體外培養成功的稚蚌成活率僅為45%。本試驗中用3種血清培養的變態稚蚌在28天均有成活，用寄主魚血清培養的鉤介幼蟲成活率顯著高于馬血清、牛血清組，且稚蚌生長較快，表明添加寄主魚血清的培養配方最適宜褶紋冠蚌鉤介幼蟲生長。

3.2 溫度對鉤介幼蟲變態率及早期稚蚌成活的影響

3.2.1 溫度對鉤介幼蟲變態率的影響 Roberts和Barnhart[16]研究A.suborbiculat證實在寄生實驗中，鉤介幼蟲在10、15℃變態率顯著高于20℃，體外培養試驗中鉤介幼蟲在20、15℃時變態率顯著高于10℃。本試驗最低溫度與Roberts和Barnhart[16]的最高溫度相近，都產生了較高的變態率，可能是A.suborbiculat和褶紋冠蚌同屬于長期發育類型，寄生繁育水溫較低，推測長期發育類型的蚌科鉤介幼蟲變態發育隨溫度變化可能呈現拋物線趨勢，還需后期實驗進行研究。

3.2.2 溫度對早期稚蚌成活的影響 培養溫度分別為18、30℃、同在30℃養殖的早期稚蚌成活率不同，稚蚌殼長無顯著性差異，表明30℃培養的稚蚌雖能變態發育，但稚蚌發育不完全，影響后期成活。培養溫度分別為18、24℃、同在24℃養殖的稚蚌成活率和殼長無顯著性差異，表明24℃條件培養的鉤介幼蟲發育正常。18℃條件下培養的稚蚌，在不同溫度下養殖，溫度越低，成活率越高，這可能是褶紋冠蚌為秋末春初繁殖，溫度較低，鉤介幼蟲及稚蚌更加適應在低溫下發育生長。本實驗結果與褶紋冠蚌的繁殖習性相符。

3.3 蚌類變態發育生物學零度和有效積溫的測試方法

關于三角帆蚌[22]、橢圓背角無齒蚌[23]、背瘤麗蚌[24]等鉤介幼蟲變態發育的生物學零度和有效積溫都有報道，研究者均采用魚體寄生方法來測定，而鉤介幼蟲的寄生變態發育時間主要受到養殖水溫、寄主魚營養、寄生部位及鉤介幼蟲質量等影響，這導致鉤介幼蟲在寄主魚上脫落持續期存在較大差異[25]，給變態發育有效積溫和生物學零度估算帶來較大誤差。采用體外培養技術可有效降低溫度變化、營養差異對幼蟲變態發育帶來的影響，更加科學對有效積溫和生物學零度的估算。此外，本研究也表明：在體外培條件下，溫度越高，幼蟲完成變態發育的持續期越短；但在相同培養條件下，幼蟲變態時間仍存在一定差異，這可能與幼蟲個體質量差異有關。

4 結論

本研究采用體外培養技術獲得了以鳙魚血漿、馬血清、胎牛血清為營養源的褶紋冠蚌稚蚌，對獲得稚蚌的后期生長發育進行跟蹤觀察。結果表明：有多種血漿（血清）可以使褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態發育，但變態率、稚蚌成活率、稚蚌生長率不同，以鳙魚血漿為營養源的培養配方最適宜褶紋冠蚌鉤介幼蟲變態發育及稚蚌生長。