葡萄根癌病病原菌的篩選及鑒定

尹向田，魏彥鋒，徐 亮，楊 陽

（1山東省葡萄研究院/山東省葡萄栽培與精深加工工程技術研究中心，濟南250100；2北京市大興區林業工作站，北京102600）

0 引言

葡萄根癌病是世界上普遍發生的一種細菌病害，在國內主要葡萄栽培地區均有分布。得病后植株生長衰弱，產量下降，嚴重者全株枯死，已成為對葡萄優質高效、安全生產潛在危險較大的病害[1]。葡萄根癌病菌屬于土壤桿菌屬，它可從傷口侵染多種植物的根莖部，使植物細胞轉變成自發性增生的腫瘤細胞，引起癭瘤癥狀[2-3]。土壤桿菌屬內菌株生物多樣性顯著，同種寄主植物上病原菌可能不同，并且不同化學殺菌劑及生防制劑對不同類型的土壤桿菌表現出不同的抑制效果[4-5]。

根癌土壤桿菌有3個變種，即Agrobacterium tumefaciens、Agrobacterium rhizogenes和Agrobacterium vitis[6-7]。Panagopoulos等首次發現為害葡萄菌株不同于其他根癌土壤桿菌，1900年Ophel和Kerr將侵染葡萄的根癌農桿菌定義為一個新種A.vitis[8-9]。葡萄根癌病主要由葡萄土壤桿菌引發，少數由根癌土壤桿菌引起[10-11]。國內，1985年游積峰等[12]首次對葡萄根癌病病原菌類型進行鑒定，之后并未有對山東地區釀酒葡萄根癌病病原菌的報道。根癌土壤桿菌的致病性與細菌細胞內的Ti質粒有關。當病原菌侵染寄主時，Ti質粒的一部分(T-DNA)轉入并整合到寄主基因組中，借助植物的轉錄和翻譯系統進行表達[13]。T-DNA編碼的基因在寄主植物腫瘤表達時可產生一類稱為冠癭堿的氨基酸衍生物。為病原菌提供營養和能量[14-15]。根據細菌侵染植株形成腫瘤產生的冠癭堿類型，可將Ti質粒分為章魚堿型、胭脂堿型、農桿堿型和農桿菌素堿型4種類型[16]。葡萄土壤桿菌的Ti質粒以章魚堿為主。

‘赤霞珠’葡萄為濟南南部山區主要釀酒葡萄品種之一，近幾年根癌病發生極為嚴重，個別地塊發病率能達到60%，造成極大的經濟損失。近幾年對葡萄根癌病的研究也相對較少。本研究從濟南南部山區采集新鮮發病的葡萄癭瘤用稀釋平板法分離得到根癌土壤桿菌類似菌株，采用形態學、生理生化特征及16S rDNA對病原菌進行鑒定，利用接種實驗確定發病較強的菌株，并通過質粒中編碼冠癭堿相關基因的檢測明確該病原菌類型，從而為采取有效措施防治葡萄根癌病打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 葡萄根癌病組織 葡萄根癌病組織材料于2016年8月采自濟南市南部山區，寄主為5年生‘赤霞珠’葡萄。

1.1.2 供試菌株 葡萄根癌土壤桿菌(Agrobacterium vitis)IAM14140購買自中國微生物菌種保藏管理中心。實驗于2016年8月—2017年12月在山東省葡萄研究院良種與栽培研究室進行。

1.1.3 致病性檢測植物

（1）向日葵幼苗。向日葵種子28℃培養箱中保濕催芽，萌發后播種于100 mm×100 mm穴盤中，每盆5顆，2片子葉伸出土面5 cm左右時接種。

（2）胡蘿卜組織塊。將新鮮胡蘿卜用酒精消毒后切成厚度約1 cm的圓片，置于鋪有濾紙的培養皿中，濾紙加入無菌水保濕。

（3）葡萄幼苗。選取一年生盆栽葡萄幼苗，待葉片長出5片時接種。

1.1.4 培養基

（1）MW培養基（用于土壤桿菌的分離）。甘露醇10.0 g，K2HPO40.3 g，NaNO35.0 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，NaCl 2.0 g，生物素100 μg，0.1%Fe-EDTA 2 mL，0.1%結晶紫2.0 mL，瓊脂粉20.0 g，加蒸餾水至1 L，pH 7.0～7.2。

（2）YEB培養基（用于活化、保存病原菌）。酵母提取物1 g，牛肉浸膏5 g，蛋白胨5 g，蔗糖5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，加蒸餾水至1 L，瓊脂15 g或不加，pH 7.8。

1.2 病原菌的分離

參照馬德欽等[5]的方法，取根癌瘤內部新鮮組織用5%的次氯酸鈉溶液消毒5 min，并經無菌水漂洗后放入研缽中，加少量無菌水搗碎混勻后，用無菌水分別稀釋10、100倍，取稀釋好的上清液涂于MW培養基平板上，28℃下培養5～7天，挑取表面光滑、圓形突起菌落，置于YEB培養基平板上純化，于4℃保存待用。

1.3 病原菌的鑒定

1.3.1 菌株形態學及生理生化鑒定 挑取菌株單菌落于YEB平板上劃線并置于28℃培養4天，觀察單菌落形態。進行革蘭氏染色后在油鏡下觀察菌體形態；生理生化鑒定參照任欣正等[17]的方法。

1.3.2 葡萄根癌病菌的16S rDNA序列分析 采用天根細菌基因組DNA小量制備試劑盒提取DNA，用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’進行 PCR擴增，PCR產物用天根DNA凝膠回收試劑盒回收后，委托上海派森諾生物科技股份有限公司進行測序，將所得到的16S rDNA序列用NCBI Blast程序與NCBI ribosomal RNA sequence數據庫中的數據進行比對，利用MEGA6.0軟件繪制系統發育樹。

1.4 病原菌的致病性測定

挑取保存的菌株與YEB平板上劃線，28℃培養72 h，挑取單菌落于YEB液體培養基中28℃160 r/min培養24 h，制備濃度為1×108cfu/mL的菌懸液。以劃傷接種方式用滅菌脫脂棉蘸取菌液接種到向日葵及葡萄幼苗根莖處，用保鮮膜包裹并保濕；胡蘿卜圓盤接種采用涂抹法。以無菌水處理為對照，將接種材料置于28℃、光照4000 lx條件下培養，每隔7天觀察統計腫瘤生長情況。

1.5 葡萄根癌病菌的質粒類型測定

根據趙小蘭等[18]方法設計引物，擴增章魚堿型質粒的引物為ZYJ1(5’-ATGGCTAAAGTGGCAATTTT GGG-3’)、ZYJ2(5’-TCAGATTGAATTCGCCAACTC G-3’)。擴增胭脂堿型質粒的引物為YZJ1(5’-TGAC AGGATATATTGGCGGGTAA-3’)、YZJ2(5’-TGCTC CGTCGTCAGGCTTTCCGA-3’)。用上述引物進行PCR擴增并測序。利用MEGA6.0軟件繪制系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 葡萄根癌病的田間發病癥狀

病害在8月時大量發生，降雨多、濕度大時癭瘤發生多。癥狀表現為在葡萄的根頸部、老齡樹干等器官上出現數個大小不等、形狀各異的癭瘤。初期形成的癭瘤較小，呈圓形突起，乳白色，較光滑，隨著瘤體的長大，顏色變深，后期呈深褐色，瘤體表面粗糙（圖1B、C、D）。受害植株生長衰弱，葉片小而黃，嚴重者全株枯死（圖1A）。

2.2 葡萄根癌病病原菌的篩選

用稀釋平板法分離葡萄癭瘤內部新鮮組織中的冠癭瘤病原菌，結果表明從根瘤內部新鮮組織中分離到40株細菌。其中在MW培養基中分離出12株菌落形態與土壤農桿菌相似的細菌，編號為JC01～JC12。將分離菌在YEB培養基純化。28℃培養3天后，12株細菌菌落均為灰白色、圓形突起、半透明、邊緣整齊、有光澤。革蘭氏染色陰性（圖2）。

圖1 葡萄根癌病田間發病癥狀

圖2 病原菌形態特征

2.3 菌株生理生化鑒定

參考《伯杰細菌鑒定手冊》及《植物病原細菌分類和鑒定》檢測根癌農桿菌生物型的方法，檢測12株菌的生物型。從表1可以看出，根據生理生化指標，12株菌包括3種類型的根癌土壤桿菌。JC02、JC05及JC11與生物Ⅲ型菌株相符合，JC01、JC03、JC06、JC07、JC09與生物Ⅰ型菌株相符合，JC04、JC08、JC10、JC12與生物Ⅱ型菌株相符合。

2.4 菌株16S rDNA鑒定結果

提取12株菌的基因組DNA，擴增其16S rDNA片段，PCR產物測序后得到長度為1403 bp的序列，將序列上傳至Genbank比對，發現與Genbank中相似度大于98%的菌株均為土壤桿菌屬(Agrobacteriumspp.)。選取相似度大于99%的17個菌株與所分離的12株菌的16S rDNA序列構建系統發育樹，由圖3可以看出，JC02、JC05、JC11與葡萄土壤桿菌(A.vitis)聚為一支。與登錄號為NR036780.1、CP000634.1、D12795.1的菌株同源性最接近。結合形態學及生理生化特征，可確定JC02、JC05、JC11為葡萄土壤桿菌。其他菌株與根癌土壤桿菌(A.temefaciens)聚為一大類，JC01、JC03、JC06、JC07、JC09與JC04、JC08、JC10、JC12分別在不同的分支上。JC01、JC03、JC06、JC07、JC09序列相似度為99.9%，同登錄號為HQ735085.1的菌株同源性最近。JC04、JC08、JC10、JC12相似度為100%，同登錄號為CP019702.1的菌株同源性最近。JC01同JC04之間的相似度為99.5%，有6個堿基不同。

2.5 菌株致病性測定

將分離出的12株細菌分別接種在新鮮的胡蘿卜圓盤、向日葵莖部及葡萄幼苗根莖部。每隔7天觀察1次接種部位。結果表明，不同菌株致病性不同，其中，JC02、JC05致病性最強，且均能使3種植物發病。JC02、JC05菌株接種胡蘿卜圓盤中心16天后出現明顯的綠色增生物質。向日葵幼苗接種JC02、JC05菌株7天后開始出現乳白色的瘤狀突起，與對照組相比，14天后，經處理的向日葵幼苗根頸部出現明顯的腫瘤凸起，腫瘤表面粗糙，肉質化。葡萄一年生幼苗接種JC02、JC05后30天在傷口部位出現了典型的腫瘤，直徑可達2 cm。JC11、JC06、JC07可形成較小的癭瘤。JC04、JC08均不能使3種植物發病。其余菌株能形成小瘤，但出現時間較長，且不長大（圖4）。

2.6 葡萄根癌病菌質粒類型測定

以YZJ1/YZJ2及ZYJ1/ZYJ2為引物對JC02、JC05進行PCR擴增，結果表明，以ZYJ1/ZYJ2為引物JC02、JC05菌株在300 bp左右均擴增出明顯條帶，未擴增出胭脂堿型質粒產物。將測序結果BLAST發現，共有7個序列與所測序列相似度較高，均大于89%，并且均為章魚堿型質粒。JC02、JC05同Agrobacterium vitis的相似度均大于90%，與A.vitisTm4及A.vitisCG474相似度為分別為99%、93%。同A.tumefaciens類型菌株相似度較低，均為89%。系統發育樹結果表明JC02、JC05同A.vitis（登錄號為U83987.1）的序列聚為一類，因此可確定JC02、JC05為章魚堿型質粒（圖5）。

表1 病原菌生理生化檢測

圖3 基于16S rDNA序列構建的葡萄根癌病病原菌相關種的系統發育樹

3 結論

本研究采集濟南南部山區‘赤霞珠’葡萄癭瘤組織進行分離。經形態學、生理生化、16S rDNA檢測表明，分離得到的根癌土壤桿菌有3種類型，以生物Ⅰ型為主。致病性檢測表明，葡萄土壤桿菌JC02、JC05致病性最強，并且均為章魚堿類型。

4 討論

根癌病的發生是由根癌土壤桿菌屬細菌引起的，根癌土壤桿菌致病性取決于病原菌的生物型[19-20]。筆者采用MW選擇培養基從葡萄幼嫩癭瘤中分離得到12株根癌土壤桿菌類似菌株，對于病原菌類型的鑒定，運用生理生化特征及16S rDNA鑒定可以初步鑒定出病原菌的生物型[21]。本試驗檢測了致病菌的生理生化特征，并將菌株的16S rDNA序列進行比對后構建系統發育樹。在分離得到的12株菌中，生化Ⅰ型5株、生化Ⅱ型4株、生化Ⅲ型3株，生化Ⅰ型更占優勢。以往研究表明，葡萄根癌病病原菌主要以生化Ⅲ型為主，這也許與土壤與環境差異有關。研究表明土壤營養條件能影響根際微生物的生長和數量[22]。寄主植物種類也與微生物種類有密切的關系[23]。

從腫瘤中，往往可分離到致瘤的和不致瘤的土壤桿菌菌系，它們在菌落形態和生理生化特性上沒有區別，因此致病性實驗是確定種不可缺少的步驟[24-25]。采用傷口接種方法將12株細菌分別接種在胡蘿卜圓盤、向日葵幼苗和葡萄幼苗上，以驗證菌株致病性及致病范圍。結果表明，不同菌株致病性差異較大，本研究也表明，葡萄土壤桿菌JC02和JC05致病性最強，均能使3種指示植物發病，致病范圍較廣。JC11雖然也屬于葡萄土壤桿菌，但是致病性較弱。大量研究均已證實葡萄土壤桿菌對葡萄根癌病致病性較強。并且相同種的不同菌株之間致病性及寄主植物范圍有差別[5,12,26]。

對于病原菌類型的鑒定，運用生理生化特征可以初步鑒定出病原菌的生物型[16]。但是對于冠癭堿類型的鑒定，還需要借助其他手段。傳統方法是擠取冠癭組織的汁液后運用高壓紙電泳確定。馬德欽等[5,12]運用Ag162Ti質粒的T-DNA區片段為探針對病原菌進行Southern雜交分析。趙小蘭等[18]以T-DNA中高度保守的virD2和ipt基因的部分序列設計引物進行PCR檢測。但是很少有對編碼生物堿基因序列的測定。本研究選取根癌土壤桿菌質粒T-DNA中編碼生物堿基因中的部分區段設計引物進行擴增并測序，結果表明同JC02和JC05類似的序列僅有7個，并且均屬于章魚堿類型。本研究僅對葡萄根癌病病原菌類型進行了鑒定，對根癌菌的生物學特性及發病規律還需進一步研究，從而為葡萄根癌病的防治打下基礎。

圖4 病原菌致病性檢測結果

圖5 基于根癌土壤桿菌質粒T-DNA部分序列的系統進化樹