醒腦靜注射液對膿毒癥大鼠急性腎損傷的改善作用及機制▲

楊 妮 鄭少微 張 瑞 周 陽 趙翊迪 張正良

(西安交通大學第二附屬醫院，陜西省西安市 710000，電子郵箱: yangni200607@163.com)

急性腎損傷是膿毒癥的常見并發癥之一，具有較高的患病率與死亡率[1]。近來研究表明，膿毒癥患者體內積聚的內毒素會誘導機體免疫系統產生過量的內源性炎癥介質，而這些炎癥介質則是導致患者發生急性腎損傷的主要病因，同時細胞凋亡、自噬、線粒體功能障礙、氧化應激等則是造成腎功能損傷的主要因素[1-4]。醒腦靜注射液是以安宮牛黃丸為底方提煉而成的新型中藥注射劑，能透過血腦屏障起到調節中樞神經功能和改善微循環的作用，其治療膿毒癥的療效也已不斷得到臨床證實[5-6]。研究表明，醒腦靜注射液對膿毒癥患者的肝臟以及心肌損傷均具有改善作用，然而其對膿毒癥所致急性腎損傷的改善作用與機制并不明確[7-8]。本研究建立膿毒癥急性腎損傷大鼠模型，分析醒腦靜注射液的治療作用，并建立腎小管上皮細胞體外模型，探究醒腦靜注射液在膿毒癥急性腎損傷中減輕細胞凋亡、炎性反應等的作用機制，為深入了解中藥制劑醒腦靜注射液的藥理機制提供依據。

1 材料及方法

1.1 實驗動物與細胞 90只雄性SD級大鼠(體重220～250 g)購自西安交通大學醫學實驗動物中心[生產許可證號：SYXK(陜)2018-001]均為8周齡，自由飲食。腎小管上皮細胞由我院中心實驗室保存。

1.2 主要試劑 醒腦靜注射液(無錫濟民可信山禾藥業股份有限公司，規格2 mL/支，國藥準字H37022632，批號：1201091)；大腸桿菌脂多糖(Sigma公司，批號：017M4112V)、核因子κB (nuclear factor kappaB,NF-κB)激活劑佛波醇脂(美國Sigma公司，批號：016P21120)；B細胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)相關X蛋白(B-cell lymphoma-2 associated X protein，Bax；批號：17082533)、Bcl-2(批號：16112411)、NF-κB(批號：17031470)、β肌動蛋白 (批號：17024502)、核纖層蛋白(Lamin)B1 (批號：17050061)一抗、羊抗兔二抗(批號：17044613)均購自上海酶聯生物研究所；細胞凋亡檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司，批號：C1062)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)、白細胞介素(interleukin,IL)-6酶聯免疫吸附實驗試劑盒(美國BioSource公司，批號：BO32822A、BO40412D)；肌酐測定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號：20170130)；尿素氮測定試劑盒(北京北化康泰臨床試劑有限公司，批號：20170826)；核蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司，批號：BB-319811)；總蛋白提取試劑盒(上海貝博生物科技有限公司，批號：BC-307702)。

1.3 大鼠膿毒癥急性腎損傷模型實驗

1.3.1 膿毒癥急性腎損傷大鼠模型制備與干預：將90只大鼠按隨機數字表法隨機分為模型組、處理組、對照組，每組30只。參照國內學者提出的方法[9-11]建模。用生理鹽水將脂多糖制成濃度為1 mg/mL的脂多糖溶液，按照10 mg/kg劑量，對模型組、處理組大鼠腹腔注射脂多糖溶液制備膿毒癥模型，對照組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。造模后通過觀察大鼠呼吸頻率、皮溫、心率、口鼻分泌物、精神狀態等判斷造模成功與否。確定造模成功后，處理組大鼠腹腔注射醒腦靜注射液(劑量6.4 mL/kg)12 h后，對照組與模型組大鼠腹腔注射等體積生理鹽水。觀察各組大鼠生存狀況。

1.3.2 血液及組織標本的采集與處理：分別于腹腔注射醒腦靜或生理鹽水后6、12、24 h，各組麻醉處死10只大鼠。無菌采集腹主動脈血約10 mL，常溫下3 000 r/min離心15 min，-20℃保存血清。無菌留取腎組織，-20℃密封。

1.3.3 腎功能的評估：取各組血清樣本，采用相應試劑盒，使用自動生化分析儀(貝克曼庫爾特AU680型)檢測樣本中血清肌酐、尿素氮。

1.4 腎小管上皮細胞模型建立及分組干預 將腎小管上皮細胞培養于含10%胎牛血清的杜氏改良伊格爾培養基(Dulbecco′s modified Eagle medium，DMEM)中，融合至80%時，以無血清培養基于37℃、5%CO2條件下培養細胞24 h后，以5 mg/L脂多糖溶液處理細胞8 h，構建細胞模型。將模型細胞分為模型組、處理組、NF-κB激活組。處理組細胞加入200 μL醒腦靜注射液(50 ng/mL)，NF-κB激活組細胞先以200 μL醒腦靜注射液(50 ng/mL)預處理6 h，再加入2 μL NF-κB激活劑佛波醇酯(終濃度1 μmol/L)共同處理細胞，模型組細胞不做處理。各組細胞培養時間均為48 h后。

1.5 炎性因子檢測 采用酶聯免疫吸附法檢測各組大鼠腎組織(經勻漿處理后)及處理后培養48 h的培養上清液中炎性因子TNF-α、IL-6水平，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.6 蛋白質印跡法檢測 取各組大鼠腎組織以及處理后培養48 h的各組細胞，提取組織的總蛋白及細胞的核蛋白，經聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜、封閉，一抗(1 ∶1 000)4℃過夜孵育，洗膜后與二抗(1 ∶500)室溫孵育1 h，采用增強化學發光法顯色，分析蛋白條帶灰度值，檢測腎組織的Bax和Bcl-2蛋白的相對表達量，以及細胞的NF-κB蛋白的相對表達量。嚴格按照試劑說明書進行操作。

1.7 細胞凋亡檢測 取各組處理后培養48 h的細胞，調整密度至1×106個/mL，以異硫氰酸熒光素(0.5 μg/mL)和碘化丙啶(0.6 μg/mL)進行雙染色，嚴格按照試劑說明書進行操作。流式細胞儀(貝克曼庫爾CytoFLEX S型)分析細胞凋亡情況。

1.8 統計學分析 采用SPSS 16.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，多組間比較采用方差分析，以Bonferroni法進行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組大鼠一般狀況及血清肌酐、尿素氮水平 模型組大鼠出現明顯的膿毒癥癥狀：呼吸、心率顯著增加，精神萎靡，少動，口鼻分泌物增多，尿色加深，出現血尿；處理組大鼠與模型組相比癥狀明顯減輕。3組間肌酐及尿素氮水平比較，差異均有統計學意義(F組間=231.001，P組間<0.001；F組間=118.201，P組間<0.001)，其中在干預后6 h、12 h、24 h，模型組、處理組的肌酐值及尿素氮均高于對照組(均P<0.05)，處理組的肌酐值及尿素氮值均低于模型組(均P<0.05)；肌酐及尿素氮水平均有隨時間變化的趨勢(F時間=218.301，P時間<0.001；F時間=494.603，P時間<0.001)；肌酐及尿素氮的分組與時間有交互效應(F交互=55.350，P交互<0.001；F交互=155.003，P交互<0.001)。見表1。

表1 3組大鼠血清肌酐與尿素氮水平的比較(x±s)

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

2.2 3組大鼠腎組織炎性水平比較 3組間TNF-α及IL-6水平的比較，差異均有統計學意義(F組間=558.101，P組間<0.001；F組間=84.080，P組間<0.001)，其中，在干預后6 h、12 h、24 h，模型組、處理組的TNF-α及IL-6均高于對照組(均P<0.05)，處理組的TNF-α及IL-6均低于模型組(均P<0.05)；TNF-α及IL-6均有隨時間變化的趨勢(F時間=81.730，P時間<0.001；F時間=375.041，P時間<0.001)；TNF-α及IL-6的分組與時間有交互效應F交互=28.870，P交互<0.001；F交互=170.300，P交互<0.001)。見表2。

表2 3組大鼠腎組織中炎性因子TNF-α、IL-6水平的比較(x±s，pg/mL)

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.3 3組大鼠腎組織凋亡相關蛋白的表達以及細胞凋亡率比較 處理組、模型組大鼠腎組織中Bax水平較對照組增高，而Bcl-2水平則降低(P<0.05)；處理組Bax水平較模型組降低，Bcl-2水平較模型組升高(P<0.05)，見圖1與表3。模型組細胞凋亡率較對照組增加，而處理組細胞凋亡率則較模型組下降(均P<0.05)，見圖2與表4。

圖1 3組大鼠腎組織中Bax、Bcl-2表達水平的比較

表3 3組大鼠腎組織中Bax、Bcl-2蛋白相對表達水平(x±s)

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

圖2 3組細胞凋亡水平的比較

表4 3組細胞凋亡率(x±s，%)

注：與對照組比較aP<0.05；與模型組比較bP<0.05。

2.4 3組腎小管上皮細胞的凋亡率及炎癥因子水平比較 NF-κB激活組、處理組細胞 NF-κB量、TNF-α、IL-6水平及細胞凋亡率較模型組降低 ，而NF-κB激活組NF-κB組、TNF-α、IL-6水平較處理組升高(P<0.05)，見圖3、圖4與表5。

圖3 3組細胞中NF-κB水平的比較

表5 3組細胞中NF-κB、TNF-α、IL-6水平及細胞凋亡率比較(x±s)

注：與模型組比較aP<0.05；與處理組比較bP<0.05。

圖4 3組細胞凋亡率的比較

3 討 論

醒腦靜注射液是由天然麝香、冰片等中藥材提煉而成的中藥注射劑，對于多種病因引發的腦損傷、意識障礙、急性酒精中毒等均具有顯著療效[6,12-15]。研究表明，醒腦靜注射液可有效降低膿毒癥大鼠腦、心臟以及肝臟組中織線粒體的氧化應激水平，提高機體對氧自由基的清除能力，并能抑制TNF-α、IL-1、IL-6等細胞炎性因子水平，從而減輕膿毒癥引起的腦、肝臟以及心肌損傷[7-8,16]。然而醒腦靜注射液是否也能夠改善膿毒癥引起的急性腎損傷，目前尚未明確，相關作用機制的研究也較少。本研究結果顯示，模型組及處理組大鼠均出現膿毒癥癥狀，且血清肌酐值及尿素氮水平均高于對照組(均P<0.05)，提示膿毒癥大鼠模型建立成功，且大鼠均出現了急性腎功能損傷；但處理組大鼠的膿毒癥癥狀輕于模型組，且在干預后6 h、12 h、24 h其血清肌酐及尿素氮水平均低于模型組(均P<0.05)，提示醒腦靜注射液可改善大鼠膿毒癥癥狀，并減輕其腎功能損傷。

腎臟上皮細胞凋亡及大量炎性因子的釋放是引發膿毒癥急性腎損傷的主要病理生理基礎[17-18]。TNF-α、IL-1、IL-6等大量前炎癥因子的形成，可引發黏附分子、血小板活化因子、前列腺素E2、白細胞三烯等的過量產生和活化，導致微血管功能紊亂、通透性增加，引起腎灌注不良、腎內血流異常、腎組織炎性細胞浸潤，造成腎小管和腎小球功能障礙和結構損傷[19-20]。而發生膿毒癥時凋亡相關因子Bax的表達水平增高，凋亡抑制因子Bcl-2的表達量降低，從而引起腎臟細胞凋亡，直接導致腎臟損傷[21-22]。既往研究表明，干預細胞凋亡可減輕腎臟的損傷程度[23]，這為膿毒癥所致腎損傷提供了新的治療策略。目前，關于醒腦靜注射液對細胞凋亡調控作用的研究主要集中在神經細胞領域，其在神經細胞凋亡的誘導啟動、凋亡相關因子表達活化、凋亡過程的執行等多個環節均能發揮抑制作用，從而抑制神經細胞凋亡，對腦損傷發揮保護作用[24]。本研究結果顯示，干預后對照組、處理組、模型組大鼠腎組織的炎性因子TNF-α、IL-6水平以及Bax蛋白表達水平均依次升高，而Bcl-2蛋白表達水平則依次降低(P<0.05)。這提示醒腦靜注射液能顯著抑制體外脂多糖誘導的炎性因子水平及腎小管上皮細胞的凋亡，其對膿毒癥所致急性腎損傷的改善作用，可能與其抑制炎性因子過度產生及腎臟細胞凋亡密切相關。

核轉錄因子NF-κB在膿毒癥的發生發展過程中也具有重要作用：靜息狀態下，NF-κB于細胞質中與抑制因子相結合并處于無活性狀態；當抑制因子被磷酸化降解，NF-κB得以釋放并轉移至細胞核，發揮調控基因表達的作用[25-26]。研究表明，發生膿毒癥急性腎損傷時，近端腎小管中NF-κB表達顯著增強，NF-κB能夠上調TNF-α、IL-6、IL-8等炎性因子水平而加重腎臟炎癥反應，并對細胞凋亡過程具有促進作用，同時參與內毒素等所引發的腎損傷過程[27-30]。有學者報告醒腦靜注射液可通過調控NF-κB信號通路，從而減輕膿毒癥大鼠模型的心肌損傷程度[31]。余文靜等[32]發現，醒腦靜注射液也能通過抑制Toll樣受體4/NF-κB通路的活化，對內毒素休克引起的腎損傷發揮保護作用。本研究結果顯示，NF-κB激活組、處理組細胞 的NF-κB、TNF-α、IL-6水平及細胞凋亡率均較模型組降低 ，且處理組細胞的NF-κB、TNF-α、IL-6水平低于NF-κB激活組(P<0.05)。這提示醒腦靜注射液可抑制脂多糖誘導的NF-κB活化，進而抑制腎小管上皮細胞的凋亡及炎性反應。

綜上所述，醒腦靜注射液可減輕膿毒癥大鼠的癥狀及急性腎損傷，這可能與其調控NF-κB活性，從而抑制腎小管上皮細胞的凋亡及炎性因子的釋放有關。