基于網絡藥理學消積化瘀丸治療原發性肝癌的活性成分及作用機制分析▲

陸運鑫 唐偉智 侯恩存

(1 廣西中醫藥大學附屬瑞康醫院腫瘤科，南寧市 530011，電子郵箱yunxinlu99@163.com；2 廣西中醫藥大學研究生院，南寧市 530001)

在我國，原發性肝癌的患病率在惡性腫瘤中僅次于肺癌、胃癌，且死亡率逐漸上升，僅次于肺癌，對人們的健康和生命造成極大威脅[1-2]。目前，原發性肝癌的主要治療方法有肝切除術、肝移植、介入治療、放化療、生物靶向治療等[3]，而中藥治療肝癌在我國具有較長的歷史，并且具有多方、多靶點、不易耐藥等優勢[4]，其治法主要有扶正去邪、疏肝健脾、解毒化瘀、軟堅散結等[5]。

消積化瘀丸由炙黃芪、黨參、鹿角膠、菟絲子、山慈菇、全蝎、蜈蚣、守宮、土鱉蟲、三七、蛇六谷、生牡蠣、鱉甲、炮山甲組成，具有扶正清毒、化瘀消積的作用。該方可提高免疫力，抑制腫瘤的生長，減少復發轉移，可用于非小細胞肺癌、肝癌的治療[6-7]。但消積化瘀丸治療原發性肝癌的活性成分和作用機制仍未完全明確。網絡藥理學的原理是基于“疾病-基因-靶點-藥物”相互作用網絡，系統、綜合地觀察藥物對疾病網絡的影響，從而揭示藥物協同作用于人體的規律。該研究策略的整體性、系統性特點，與中醫學從整體的角度診治疾病的理論，以及中藥及其方劑的多成分、多途徑、多靶點協同作用的原理殊途同歸[8]。本研究將基于網絡藥理學，探討消積化瘀丸多種藥物的主要活性成分及其治療原發性肝癌的機制，為消積化淤丸的臨床使用提供參考。

1 資料與方法

1.1 消積化瘀丸活性成分的篩選 消積化瘀丸由黃芪、黨參、鹿角膠、菟絲子、山慈菇、蛇六谷、全蝎、蜈蚣、守宮、土鱉蟲、三七、牡蠣、鱉甲、炮山甲等14味中藥組成，通過TCMSP數據庫(http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php )[9]、BATMAN-TCM數據庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)[10]、DrugBank數據庫(https://www.drugbank.ca/)[11]收集這14味中藥活性成分。在TCMSP數據庫中，參照文獻[12]，設定生物利用度≥30%和類藥性≥0. 18，篩選出符合條件的活性成分，并將多個數據庫收集的活性成分進行合并去除重復。

1.2 中藥活性成分靶點的預測 通過PharmMapper平臺(http://lilab.ecust.edu.cn/pharmmapper/submit_file.php)[13]查詢活性成分的作用靶點信息，同時剔除非人源靶點。將活性成分的分子結構以mol2格式上傳到PharmMapper平臺服務器，設定返回靶點數為300，并選擇藥效團模型作為設定條件，提交后由該平臺完成活性成分靶點的預測。提取對接分數較高的前30個靶點，經過校正和轉換，得到活性成分作用的人源相關蛋白靶點。將收集到的中藥活性成分以及預測的成分靶點蛋白通過Cytoscape軟件制作成分-靶點網絡。

1.3 原發性肝癌相關蛋白的收集 通過PubMed MeSH數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/)獲取原發性肝癌的關鍵詞，主要有liver neoplasm、hepatocellular cancer、cancer of the liver。通過檢索OMIM數據庫(https://omim.org/)[14]、TTD數據庫[15]、CTD數據庫(http://ctdbase.org/)獲得原發性肝癌相關蛋白，并將各個數據庫獲取的原發性肝癌相關蛋白合并去重。

1.4 消積化瘀丸治療原發性肝癌靶蛋白的相互作用網絡構建 為探究消積化瘀丸治療原發性肝癌的作用機制，利用在1.2和1.3中分別收集到的人源相關靶點蛋白及原發性肝癌相關蛋白，通過VennDiagram平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)制作文氏圖，獲得相互交集的靶蛋白。通過STRING數據庫(https://string-db.org/)，針對消積化瘀丸治療原發性肝癌靶蛋白構建蛋白-蛋白相互作用(protein-protein interaction ,PPI)網絡圖，并利用Cytoscape軟件將網絡圖可視化[16-17]。

1.5 消積化瘀丸治療原發性肝癌靶點的富集分析與通路分析 通過DAVID在線分析工具(https://david.ncifcrf.gov/)，對PPI網絡關系中的靶點進行基因本體(Gene Ontology，GO)富集分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路分析。GO分析中選擇生物進程、分子功能及細胞組分3項內容繪制條形圖。通過KEGG Mapper平臺(https://www.kegg.jp/kegg/mapper.html)查找富集出來的生物通路圖，并利用 OmicShare(https://www.omicshare.com/)將得到的通路分析結果進行可視化。

2 結 果

2.1 消積化瘀丸14種中藥的活性成分 共收集到黨參21個成分、黃芪20個成分、三七6個成分、山慈菇3個成分、菟絲子8個成分、蛇六谷(魔芋)1個成分、鱉甲1個成分、鹿角膠2個成分、炮山甲2個成分、全蝎7個成分、牡蠣6個成分、壁虎(守宮)2個成分、土鱉蟲(蟄蟲)1個成分、蜈蚣7個成分，見表1。

表1 消積化瘀丸14種中藥的活性成分

2.2 藥物活性成分的靶點及原發性肝癌相關蛋白 進一步通過PharmMapper平臺反向分子對接實驗，得到藥物活性成分預測靶點，選取每個成分得分最高的前 30個靶點蛋白，經過校正，并剔除重復及非人源靶點后，得出消積化瘀丸的作用靶點共368個；在成分-靶點網絡中，對796個靶蛋白節點進行分析，結果顯示有80個靶蛋白具有10個以上相互作用的活性分子，其中度值較高的主要有硬脂酸、異黃酮、苦參堿。通過OMIM、TTD、CTD、DrugBank數據庫搜索原發性肝癌相關蛋白，合并去重后獲得32935個肝癌相關蛋白。

2.3 消積化瘀丸治療原發性肝癌靶蛋白的PPI網絡 通過制作文氏圖獲得消積化瘀丸活性成分靶點與原發性肝癌相關蛋白交集的靶蛋白365個，建立PPI網絡圖(見圖1)，該網絡包含328個節點和2 120條相互作用關系，應用Cytoscape軟件插件NetworkAnalyzer進行分析，發現關鍵節點主要有腫瘤抑制蛋白p53、蛋白激酶B1、核轉錄因子激活蛋白、絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1，其中度值最高的是腫瘤抑制蛋白 p53。

圖1 消積化瘀丸作用于原發性肝癌靶蛋白的PPI網絡圖

2.4 消積化瘀丸作用于原發性肝癌靶蛋白的GO富集分析 為更進一步了解候選靶點的作用機制，通過DAVID在線分析工具對消積化瘀丸治療原發性肝癌的365個靶點進行GO富集分析，制作消積化瘀丸治療原發性肝癌靶點的GO富集分析中生物過程、分子功能和細胞組成排名前20的條狀圖(見圖2)。在生物進程中，RNA聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調節、對藥物反應、細胞增殖負調控、細胞增殖正調控、DNA模板轉錄的正調控和凋亡過程的負調控排位靠前；在細胞組成中，細胞質、胞漿、漿膜排位靠前；在分子功能中，三磷酸腺苷結合、蛋白質均聚活性、同一蛋白結合、蛋白激酶結合排位靠前。

2.5 消積化瘀丸作用于原發性肝癌靶蛋白的通路分析 使用DAVID在線分析工具對消積化瘀丸作用于原發性肝癌的365個靶蛋白進行通路分析，制作20個富集靶蛋白數量最多的通路的氣泡圖(見圖3)，顏色從綠色到紅色反映了P值從大到小，節點從小到大反映了靶蛋白相關聯的富集基因數量從少到多，其中富集因子值越大，其富集的程度越大。結果顯示，消積化瘀丸作用于原發性肝癌的靶點主要富集于氨酰tRNA生物合成信號通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號通路。

靶蛋白(個)

靶蛋白(個)

靶蛋白(個)

富集因子

圖3 消積化瘀丸作用于原發性肝癌靶點的通路富集分析氣泡圖

3 討 論

肝癌在中醫歸類為“積聚”“痞氣”“瘕積”等疾病范疇，王文志等[18]認為，正氣不足導致臟腑功能失調，邪毒內生，引起氣滯血瘀、脈絡閉阻是其內因；飲食不節、情志失調、外感邪氣是其外因，內外因相結合，從而導致肝癌的發生。消積化瘀丸便是以扶正清毒、化瘀消積為治法，輔助治療原發性肝癌。臨床研究表明，消積化瘀丸聯合經導管動脈化療栓塞術或聯合射波刀治療原發性肝癌，均取得了顯著的療效[6,19]。

韓明等[20]通過研究觀察壁虎活性單體衍生物腺嘌呤發現，腺嘌呤可顯著地抑制腫瘤細胞的增殖，從而導致肝癌細胞凋亡。壁虎(守宮)是消積化瘀丸組成藥物之一，而本研究結果顯示腺嘌呤為消積化瘀丸治療原發性肝癌的主要活性成分之一。此外，消積化瘀丸中的主要活性成分還有硬脂酸、異黃酮、苦參堿，主要存在于炮山甲、黃芪、菟絲子中。研究表明，硬脂酸治療肝毒性有益[21]；異黃酮屬于黃酮類化合物，其對大鼠肝癌 CBRH-7919 細胞的生長具有明顯的抑制作用[22]；苦參堿在抑制人肝癌細胞株HepG2的生長中也發揮重要作用[23]。

本研究中，消積化瘀丸作用于原發性肝癌的靶蛋白主要有腫瘤蛋白p53、蛋白激酶B1、核轉錄因子激活蛋白、絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1。研究表明[24]，腫瘤抑制因子p53的作用涉及細胞周期阻滯、細胞凋亡、DNA修復、衰老和新陳代謝；蛋白激酶B則通過磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶B信號通路維持細胞穩態[25]；絲裂原活化蛋白激酶3、絲裂原活化蛋白激酶1可調控細胞生長、存活和分化[26]；核轉錄因子激活蛋白為細胞核內重要的癌蛋白，其表達隨著肝癌惡性程度的增高、分化程度的降低而升高[27]。作用于上述靶蛋白的成分有腺嘌呤、5′-羥基異丁香酚-2′，5′-二-O-葡萄糖苷、組氨酸，分別主要存在于守宮、黃芪、蜈蚣中。

通路富集分析氣泡圖顯示，消積化瘀丸治療原發性肝癌涉及的通路主要有氨酰tRNA生物合成信號通路，精氨酸和脯氨酸代謝信號通路。參與氨酰tRNA生物合成信號通路的為消積化瘀丸組成中蜈蚣的活性成分亮氨酸、酪氨酸、組氨酸；參與精氨酸和脯氨酸代謝信號通路的為菟絲子的活性成分芝麻素，黨參的活性成分蒲公英酚，蜈蚣的活性成分亮氨酸、組胺和守宮的活性成分腺嘌呤。有研究表明，氨酰tRNA生物合成信號通路中的p43因子影響細胞凋亡、血管生成、細胞分化等，而另外兩種輔助因子p38和p18，分別可以抑制癌基因c-myc 的表達和參與DNA損傷修復中重要的共濟失調毛細血管擴張突變基因(ataxia telangiectasia-mutated gene， ATM)、ATM與Rod 3相關蛋白激酶-p53通路[28]。精氨酸和脯氨酸代謝信號通路主要調控脯氨酸和L-精氨酸的表達，Roger等[29]發現，細胞內L-精氨酸水平升高，可改善T細胞存活、延長真核生物壽命、調節抗腫瘤活性等；而脯氨酸是一個重要的細胞代謝和生理調節劑，影響著人類和動物的營養[30]。另外，消積化瘀丸組成中守宮、蜈蚣、牡蠣、黃芪、炮山甲、全蝎、土鱉蟲、三七、菟絲子均調控了常見的腫瘤經典通路絲裂原活化蛋白激酶信號通路。

綜上所述，消積化瘀丸可通過調節細胞凋亡、血管生成、細胞分化、抑制癌基因表達等過程發揮多靶點、多通路的協同抗腫瘤作用。但由于遺漏一些活性成分以及對關鍵成分的認識不足等，本研究尚有一定的局限性。