冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者血清LINC01184的表達水平及其臨床意義

烏宇亮 張衛萍 范力宏 王亭忠 陳 濤 白曉君

(西安交通大學第一附屬醫院心內科，陜西省西安市 710061，電子郵箱：13636810941@163.com)

冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(coronary atherosclerotic heart disease,CAD)是冠狀動脈發生粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或阻塞而導致的心臟疾病[1]。CAD的發病基礎是冠狀動脈的粥樣硬化病變，是由內皮損傷、脂質代謝異常、免疫紊亂等多重因素引起的冠狀動脈處發生的慢性代償性炎癥反應，涉及血管內膜的脂質浸潤、血管內皮細胞受損、單核細胞黏附侵襲、平滑肌細胞增生和膠原過度積累等[2]。內皮細胞炎癥損傷和平滑肌細胞增生是動脈粥樣硬化形成的關鍵環節，也是預防和治療動脈粥樣硬化的重要靶點[3]。胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)及其結合蛋白參與內皮細胞炎癥損傷和平滑肌細胞增生[4]。高通量測序及生物信息學分析表明長鏈基因間非編碼RNA 01184(long intergenic non-coding RNA 01184,LINC01184)可能參與IGF2通路的調節，從而影響內皮細胞和平滑肌細胞的功能。本文探討冠心病患者血清LINC01184的表達水平及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2015年7月至2016年9月西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科收治的232例接受診斷性冠狀動脈造影檢查的患者作為研究對象。排除標準：重度糖尿病、心肌梗死患者。根據冠狀動脈造影結果將患者分為CAD組145例和對照組87例，其中CAD組冠狀動脈有1支以上狹窄≥75%，男性86例，女性59例，年齡(58.2±14.8)歲；對照組冠狀動脈狹窄≤25%，男性42例，女性45例，年齡(57.1±15.1)歲。兩組患者一般資料比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。本研究經西安交通大學醫學院倫理委員會批準，所有患者均被事先告知詳情，并簽署知情同意書。

表1 兩組患者一般資料比較

1.2 儀器與試劑 SuperScriptⅡ逆轉錄試劑盒(美國Invitrogen公司，批號：16064014)；SYBR Green實時定量檢測試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：RR820A)；IGF2酶聯免疫吸附測定(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海酶聯生物科技有限公司，ml022801)；白細胞介素6(interleukin 6，IL-6)ELISA試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：PT158)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)ELISA試劑盒(碧云天生物技術有限公司，批號：P1330)；Bio-Rad IQ5型實時定量PCR儀(美國Bio-Rad公司)；iMarkTM型酶標儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 標本采集 采集研究對象空腹外周血6 mL于含有抗凝劑的采血管中，4℃冷藏30 min，3 000 r/min離心15 min，收取上層血清，-80℃保存備用。

1.4 血清總RNA的提取 血清于冰上融化，每250 μL血清加入750 μL TRIzol，混勻，靜置5 min；加入1/4體積的氯仿(250 μL)，蓋緊管蓋，劇烈搖晃混勻，靜置10 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，小心吸取上清，轉移至無RNA酶的離心管中，加入等體積的異丙醇，搖晃混勻，室溫靜置10 min；4℃下12 000 r/min離心10 min，棄上清，加1 mL 75%乙醇溶液(無RNA酶)；4℃下12 000 r/min離心10 min，棄乙醇，吸干剩余液體(避免觸及沉淀)，超凈工作臺晾干，用20 μL無RNA酶的ddH2O溶解沉淀，核酸定量儀測定RNA的濃度和純度。

1.5 實時定量PCR檢測LINC01184的表達水平 運用SuperScriptⅡ逆轉錄試劑盒將RNA反轉錄成cDNA，采用實時定量PCR檢測LINC01184相對表達量，試劑為SYBR Green實時定量檢測試劑盒。反轉錄的反應體系為20 μL，包括總RNA 1 μL，引物1 μL，5×反應緩沖液 4 μL，20 U/μL RNA酶抑制劑1 μL，10 mM dNTP混合物2 μL，逆轉錄酶(200 U/μL)1 μL，加ddH2O至20 μL。渦旋混勻，42℃反應60 min，70℃加熱5 min結束反應，獲得cDNA。取適量cDNA模板、0.4 μmol/L上下游引物，在Bio-Rad IQ5型熒光定量PCR中進行反應。PCR反應條件：94℃預變性3 min；94℃ 20 s，55～60℃ 20 s，72 ℃ 30 s，共40個循環。實驗重復3次，每個樣本設3個副孔。以3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)為內參基因。LINC01184引物序列為上游：5′-GCG GTC TTC TCT GTC TTC TTT-3′，下游：5′-CTC CTG TTC GTG TCA GCA ATA-3′；GAPDH引物序列：上游：5′-CTC AGA CAC CAT GGG GAA GGT GA-3′，下游：5′-ATG ATC TTG AGG CTG TTG TCA TA-3′。以2-△△Ct計算LINC01184的相對表達量。

1.6 血清IGF2、IL-6，TNF-α水平檢測 采用ELISA檢測血清IGF2、IL-6和TNF-α的水平，按試劑盒所附說明書進行操作。

1.7 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用t檢驗；計數資料以例數(百分比)表示，組間比較采用χ2檢驗；相關性分析采用Pearson相關分析法。以P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 兩組患者血清LINC01184相對表達水平 對照組血清LINC01184相對表達水平為(1.00±0.38)，CAD組為(4.50±1.81)，CAD組血清LINC01184相對表達水平高于對照組(t=3.681,P=0.007)。

2.2 兩組研究對象血清IGF2、IL-6和TNF-α水平比較 CAD組血清IGF2、IL-6和TNF-α水平分別為(133.2±14.1)ng/mL、(147.3±16.3)ng/mL和(154.6±15.7)ng/mL，對照組分別為(20.5±4.2)ng/mL、(18.2±3.3)ng/mL和(15.5±2.6)ng/mL，CAD組血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于對照組(t=4.598、4.659、5.542，均P<0.001)。

2.3 CAD組患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平與LINC01184相對表達水平的相關性 相關性分析結果顯示，CDA組患者血清LINC01184相對表達水平與IGF2、IL- 6及TNF- α水平均呈正相關(r=0.902， 0.823，0.756，均P<0.001)。見圖1。

圖1 CAD患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平與LINC01184相對表達水平相關性分析

3 討 論

研究表明，遺傳變異是心血管疾病發生的重要原因，40%的冠心病是遺傳因素造成的[5]。人類基因組的基因只有10%編碼為蛋白質，而有85%以上轉錄為非編碼RNA，考慮可變剪接的情況下，非編碼RNA數目可能是蛋白編碼基因的數倍乃至數十倍[6]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA, LncRNA)可在表觀遺傳、轉錄水平、轉錄后水平以及翻譯后水平調控基因表達，其作用機制復雜，是發掘人類疾病、診斷及評估預后的標志物和治療靶點的分子庫[7]。

CAD的早期診斷對其治療效果有重要影響，但CAD早期癥狀不明顯，甚至無癥狀，早期診斷非常困難，易造成漏診而耽誤最佳治療時機。雖然冠狀動脈造影、冠脈CT血管成像檢查可明確冠狀動脈硬化和狹窄程度，但這些檢測手段存在價格昂貴、創傷性以及放射線輻射等不足，臨床上難以普及。因此，如何找到價格低廉、無創傷且無輻射的早期診斷標志物，成為CAD診治研究的熱點[8]。隨著基因組學及蛋白組學的發展，循環LncRNA檢測在心臟病早期診斷中的潛在價值逐漸顯現，且其檢測無創傷、無輻射、費用低廉，易于臨床的推廣和普及[9]。有研究證實循環中LncRNA H19和LIPCAR水平升高會增加冠心病發生風險[10-11]。本研究結果也顯示CAD組患者血清LINC01184相對表達水平高于對照組(P<0.05)，提示LINC01184可能成為冠心病早期診斷和治療的靶標。

炎癥是CAD乃至幾乎所有心血管疾病發生發展的重要推動因素，貫穿CAD發生發展的整個過程。LncRNA作為炎癥反應的潛在關鍵調節因子，參與炎癥因子基因表達的轉錄和轉錄后調控[12]。LncRNA可能作為一種轉錄增強子或轉錄抑制因子，或作為支架的分子通過與染色質重塑復合物RNA結合蛋白的相互作用，或者通過競爭性結合某些特異的miRNA起到調節炎癥因子基因的轉錄和翻譯的作用[13]。研究發現，LINC01184在多種炎癥相關疾病中異常表達，如阿爾茨海默病、心血管疾病、自身免疫性疾病及代謝綜合征等，而在這些疾病中LINC01184可能調節IGF2、表皮生長因子受體等多個信號通路[14]。IGF2通過結合其受體或結合蛋白而調節細胞增殖、遷移、存活。IGF2與心血管疾病的發展有關，研究證實IGF2基因參與代謝綜合征、2型糖尿病以及CAD的發生發展[15]。研究發現，IGF2過表達可以導致心肌結構重塑，包括心肌肥厚、左心室增大、心律失常和低血壓[16]。IL-6和TNF-α是兩種經典的促炎癥因子，與CAD的發生發展密切相關[17]。本研究結果顯示，CAD組患者血清IGF2、IL-6和TNF-α水平均高于對照組，且血清LINC01184表達水平與IGF2、IL-6和TNF-α水平均呈正相關(均P<0.05)，提示LINC01184可能參與CAD病理過程中炎性反應和心肌重塑過程，但其分子機制仍需進一步研究。

綜上所述，CAD患者血清LINC01184水平升高，LINC01184或可作為CAD診斷和評估預后的潛在血清標志物，但其影響CAD發展的具體作用機制仍有待進一步深入研究。