肺結核患者血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平及其診斷新發肺結核的價值 ▲

方志雄 徐 磊 張海明 林 沙

(湖南省湘潭市中心醫院感染科，湘潭市 411100，電子郵箱：fzx8214907@163.com)

肺結核是由結核分枝桿菌(MycobacteriumTuberculosis，MTB)引起的傳染性疾病，在全世界范圍內均具有較高的發病率，根據世界衛生組織的報告，2015年全球結核病患病人數已超過800萬，其中近100萬患者因肺結核死亡[1]。目前診斷肺結核的主要手段為細菌學檢測，但常規痰涂片的敏感性較低，而痰培養的周期長達1～2個月，時效性不佳[2]。流行病學研究表明，只有5%～10%感染MTB的患者最終會發展為活動性結核[3]，這表明人體免疫系統具有較強的保護力，能夠有效地抑制體內MTB的繁殖以防止發展成活動性疾病。CD4+T淋巴細胞是T淋巴細胞中的重要亞群，在細胞免疫中發揮了重要作用，其狀態與結核活動密切相關。而CD27是腫瘤壞死因子受體家族的成員，在細胞免疫中具有重要作用[4]。目前，關于結核病患者血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平的研究較少，且其對新發結核病的診斷價值仍未明確。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年6月至2017年6月間在我院確診的33例新發肺結核Ⅰ型進展期患者為新發組。納入標準：(1)結合臨床表現、影像學表現，經痰涂片或痰培養確診為肺結核的新發患者；(2)未經抗結核藥物治療；(3)不存在免疫系統疾病和血液系統疾病；(4)近3個月未服用增強或抑制免疫的藥物。排除標準：(1)先天性或獲得性免疫功能異常患者；(2)合并其他肺部感染患者；(3)存在惡性腫瘤和嚴重肝腎功能障礙患者。選擇同期經抗結核藥物治療后細菌檢測結果為陰性的33例肺結核患者為經治組。納入標準：(1)既往臨床表現、影像學表現符合肺結核，并經痰涂片或痰培養確診為肺結核，并經抗結核藥物治療后痊愈(痊愈定義為痰涂片陽性肺結核患者完成規定療程，連續2次痰涂片結果陰性，其中1次是治療末[5])；(2)痰培養結核桿菌陰性；(3)近3個月未服用增強或抑制免疫的藥物。排除標準同新發組。另選擇同時期、同年齡段的33例健康者作為對照組。3組患者的年齡、性別、體質指數及外周血白細胞計數、淋巴細胞百分比比較，差異均無統計學意義(均P>0.05)，具有可比性，見表1。

表1 3組患者的一般資料

1.2 研究方法

1.2.1 主要試劑與儀器：淋巴細胞提取液(美國GE醫療，批號：150311)，改良RPMI-1640培養基(美國Sigma，批號：160243)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)標記的鼠抗人CD4、CD154和CD27抗體(英國Biorbyt公司，批號：141209、141104、150104)；皮內注射用卡介苗(陜西醫藥控股，國藥準字：S10960096；0.25 mg/支；批號：150903)。CytomicsTMFC 500全自動五色數字化流式細胞儀(美國Beckman Coulter公司)；7E-A/B吸痰器(魚躍醫療)。

1.2.2 血標本處理：抽取所有研究對象靜脈血2 mL至乙二胺四乙酸抗凝管中，混勻后，將1.5 mL血標本加到15 mL淋巴細胞提取液表面，以2 000 r/min離心20 min，隨后分離外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)，依照淋巴細胞提取液說明書進行分離。

1.2.3 痰液標本處理：誘導排痰參照文獻[6]進行，取2 mL痰液經吸痰器過濾器濾過后置于4℃保存。1.5 mL痰液加到15 mL淋巴細胞提取液表面，以2 000 r/min離心20 min，隨后分離PBMC，依照淋巴細胞提取液說明書進行分離。

1.2.4 抗原刺激與熒光染色：將從血液和痰液中分離的PBMC分別加入96孔平底帶蓋無菌培養板中，每孔100 μL；之后每孔依次加入10 μL的10 μg/L卡介苗和10 μL PE標記的CD154抗體(滴度1 ∶64)，37℃培養16～20 h后分別加入CD4和CD27 PE熒光抗體染色劑(美國Sigma公司，批號：151270)10 μL進行染色；再次培養16～20 h后使用磷酸緩沖鹽溶液各進行1次洗滌和重懸；重懸后每孔加入3 μL抗體濃度為25 mg/mL PE標記CD4抗體和8 μL抗體濃度為25 mg/mL PE標記CD27抗體，避光染色30 min后，加入300 μL固定/破膜劑(美國Sigma公司，批號：160183)，振蕩均勻，室溫放置20 min；以1 200 r/min離心5 min去除上清液，加入檢測細胞內細胞因子用的5 μL熒光素標記抗體(美國Sigma公司，批號：160836)，混合均勻，室溫避光孵育20 min；用1 mL磷酸緩沖鹽溶液重懸洗滌細胞，以1 200 r/min離心5 min去除上清液。磷酸緩沖鹽溶液各進行1次洗滌和重懸，將樣本置于4℃避光條件下保存待檢。

1.2.5 CD27表達檢測：按照流式細胞儀操作手冊進樣后使用配套CXP軟件進行分析。從選取的淋巴細胞中以 CD4-PE-Cy5、CD154-PE設立橫縱坐標，建立二維點圖，通過CD4+CD154+T淋巴細胞門圈出CD4+T淋巴細胞(見圖1A)；從選取的CD4+T淋巴細胞中以CD27-PE-Cy7門圈出CD27+的CD4+T淋巴細胞亞群(見圖1B)。樣本細胞數均≥105個。

圖1 CD4+T淋巴細胞及表達CD27+CD4+T淋巴細胞的典型流式細胞分析圖像

1.3 統計學分析 采用SPSS 25.0軟件進行統計分析。服從正態分布的計量資料以(x±s)表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t法；不服從正態分布的計量資料采用M(P25，P75)表示，組間比較采用Kruskal-Wallis檢驗，兩兩比較采用Mann-Whitney檢驗。計數資料以例數或百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用受試者工作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線及曲線下面積(area under the curve，AUC)評價血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的效能。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 3組血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平 3組血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平比較，差異有統計學意義(均P<0.05)；其中，新發組血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平高于經治組和對照組，而經治組血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平低于對照組(均P<0.05)。見表2。

表23組血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平[M(P25，P75)，%]

組別n血液痰液新發組3376.61(71.39,85.80)ab80.32(76.07,88.61)ab經治組3333.15(24,46.02)a40.12(28.25,48.90)a對照組3360.14(54.45,68.54)56.17(46.66,66.15)H值63.16166.592P值<0.001<0.001

注：a與對照組比較，P<0.05；b與經治組比較，P<0.05。

2.2 血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的效能 以是否診斷為新發肺結核為狀態變量(新發患者為陽性，經治患者和對照人群為陰性)，以血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平為自變量進行ROC曲線分析。結果顯示，血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的AUC分別為0.883和0.912，兩者比較差異無統計學意義(z=0.725，P=0.468)。見表3和圖2。

表3 血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的ROC曲線分析結果

圖2 血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的ROC曲線

3 討 論

目前，結核的診斷和治療技術已取得了巨大進步，但肺結核的疫情并未得到顯著控制[7]。隨著我國城市化進程的加快和人口流動性的增加，肺結核的診斷、治療和管理的困難增大[8]。控制結核的傳播依賴于有效的診斷與監測方法，而常用的微生物學檢查、結核菌素試驗和胸部影像學檢查均有較大的局限性。MTB的感染和活動與T淋巴細胞的功能狀態高度相關，而基于T淋巴細胞分析的免疫學檢測用于結核的診斷和監測具有很高的潛力。相關研究顯示，γ干擾素釋放試驗已用于檢測MTB感染[9]，表現出了較高的敏感性[10]，但對于活動性結核、潛伏性結核和經治結核的診斷能力較差[11]。CD27是一種跨膜糖蛋白，也是腫瘤壞死因子受體超家族成員之一，主要分布于活化的T淋巴細胞表面，被認為是T淋巴細胞激活和炎癥反應的一種標志物[12]。研究顯示，CD27是記憶T淋巴細胞形成的必需組分，CD27通過與CD70結合，可以誘導核因子κB通路的激活，并極大地增強體內T淋巴細胞應答[13]，而敲除CD27的小鼠的記憶T淋巴細胞對刺激二次應答明顯降低[14]。動物模型研究顯示，與野生型小鼠相比，敲除CD27基因的小鼠感染病毒和MTB時，效應T淋巴細胞的數量減少，其中CD4+T淋巴細胞減少最為明顯[15]，這提示CD4+T淋巴細胞CD27的表達水平或許可用于結核病的診斷。

結核患者的免疫系統功能明顯異常，其中T淋巴細胞的亞群構成改變更為顯著，多項基于中國人群或歐美人群的免疫學研究結果均顯示，結核患者CD4+T淋巴細胞的比例和功能狀態均明顯降低[16-18]。卡介苗是臨床常用的結核疫苗，在結核病的免疫研究中也有重要作用，經卡介苗刺激后產生的T淋巴細胞具有高度的結核相關特異性，可以反映機體對于MTB的免疫狀態[19]。因此，本研究采用卡介苗對血液及痰液標本進行抗原刺激后，分析新發肺結核患者、經治肺結核患者以及健康對照人群血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平。結果顯示，新發肺結核患者血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平高于經治組和對照組(均P<0.05)。這提示血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平可能與結核感染狀態相關，與Nikitina等[20]的研究結果相似。ROC曲線分析結果顯示，應用血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平診斷新發肺結核的價值均較高，但兩者的AUC差異無統計學意義(P>0.05)。Petruccioli等[21]的研究結果顯示，血液特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平對結核患者特別是潛伏性結核患者，具有較好的診斷價值；Schuetz等[22]在針對合并HIV感染的結核患者的研究中也得出了類似結論；Portevin等[23]的研究結果顯示，基于T淋巴細胞CD27表達水平的TAM-TB檢驗用于診斷兒童結核病具有良好的敏感性和特異性。以上結果均提示將CD4+T淋巴細胞CD27表達水平應用于診斷結核病具有較大潛力。

綜上所述，肺結核患者血液和痰液中特異性CD4+T淋巴細胞CD27表達水平明顯降低，而新發結核患者更為明顯；血液和痰液中CD4+T淋巴細胞CD27表達水平對新發肺結核的診斷效能均較好。但本研究為單中心小樣本的觀察性研究，受限于納入人群范圍和樣本量，相應的診斷截點值用于其他人群的效果尚需下一步多中心大樣本研究進一步明確。