骨癌痛嗎啡耐受疼痛模型大鼠脊髓縫隙連接蛋白43的表達情況及其對環磷酸腺苷/蛋白激酶A通路、炎癥的影響▲

馮鵬玖 張愛民 蘇 明 蔡 海 趙秀霞 冉 婭

(1 廣西柳州市中醫醫院麻醉科，柳州市 545000，電子郵箱：fpjlzzyy2018@163.com；2 廣西醫科大學第二附屬醫院疼痛科，南寧市 530021)

骨癌痛是惡性腫瘤發生骨轉移后出現的一種頑固性、復合型疼痛，常發生在乳腺癌、肺癌、前列腺癌的晚期[1]。以嗎啡為代表的阿片類藥物是控制癌痛的主要藥物，但隨著病情發展，常需不斷加大藥物劑量以滿足患者鎮痛需求[2]，10%～20%骨癌痛患者的療效最終會變差，甚至無效，而這與嗎啡耐受密切相關[3]，但導致骨癌痛嗎啡耐受(bone cancer pain-morphine tolerance，BPT)的機制仍未明確。既往研究表明，持續性癌痛可引起脊髓星形膠質細胞和小膠質細胞進一步活化，白細胞介素(interleukin,IL)1β和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)α釋放增加，從而發生嗎啡耐受[4]，因此，脊髓炎癥可能是導致BPT的重要原因。而環磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶 A(protein kinase A,PKA)是調節脊髓炎性疼痛的重要信號通路[5]。還有研究結果顯示，縫隙連接蛋白43(connexin 43,Cx43)可介導非疼痛模型大鼠慢性嗎啡鎮痛耐受[6]，這提示調控Cx43可能是逆轉BPT的重要方法。為此，本研究擬在前期研究[7]的基礎上，探討Cx43對BPT模型大鼠脊髓cAMP/PKA通路及炎癥的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級SD雄性大鼠40只由廣西醫科大學動物實驗中心提供(合格證號：SCXK桂～2014～0002)，鼠齡4～6周，體重120～150 g 。

1.2 主要材料、試劑及儀器 人鼻咽癌HONE1細胞由廣西醫科大學科學實驗中心提供。Von Frey纖維絲(美國Stoelting公司)。Cx43-小干擾核糖核酸(small interfering RNA,siRNA)序列及陰性對照-siRNA序列均參考文獻[8]設計，并由上海吉瑪基因公司合成，序列見表1。嗎啡注射液(東北制藥沈陽第一制藥，國藥準字：H21022436)，一抗兔抗鼠Cx43(英國Abcam公司，批號：ab63851)、兔抗鼠cAMP(英國Abcam公司，批號：ab76238)、兔抗鼠PKA(α+β)(英國Abcam公司，批號：ab5815)，酶標羊抗兔二抗(Abnova公司，批號：PAB9387)，IL-1β和TNF-α 酶聯免疫吸附試劑盒(中國碧云天公司，批號：PI303、PT516)。MK3型酶標儀(美國賽默飛儀器有限公司)，Image Lab系統下成像儀(美國Bio-Rad公司)，500 mA聯合X射線機(日立公司)。

表1 Cx43-siRNA及陰性對照siRNA的序列

1.3 動物分組與處理 本研究的動物實驗與分子生物學實驗部分均在廣西醫科大學進行，并經廣西醫科大學動物學醫學科研倫理委員會審核備案(gxykd-倫-2018-095)。采用隨機數字表法將40只SD大鼠分為5組，每組8只，包括假手術組、骨癌痛組、BPT組、BPT+陰性對照-siRNA組(BPT-CS組)及BPT+Cx43-siRNA組(BPT-CXS組)。在實驗開始前，各組大鼠均在動物實驗中心飼養室內適應喂養3 d，每日自由作息與飲食，光照晝夜各半，進行環境適應訓練。適應完成后，在無菌操作間內，取骨癌痛組、BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組大鼠，于左后肢脛骨上端穿刺后，骨髓腔內注射接種已培養并鑒定的鼻咽癌HONE1 細胞2.4×106個(共30 μL)，假手術組則在左后肢脛骨上端穿刺后骨髓腔內注射等體積生理鹽水。 在機械刺激回縮閾值(mechanical withdraw threshold，MWT)顯著改變至穩定時(降低至不再有統計學意義的閾值變化，約建模后7 d)，聯合X射線拍片再次確定腫瘤生長，隨后BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組經頸后皮下注射10 mg/(kg·次)的嗎啡注射液，而骨癌痛組皮下注射等體積的生理鹽水，2次/d，持續1周。在MWT出現顯著改變并穩定(降低至不再有統計學意義的閾值變化，約建模后10 d)后，參照文獻[8]對BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組大鼠進行硬膜外置管并建立皮下隧道后固定于頸后方，然后BPT-CXS組鞘內注射Cx43-siRNA(2 μg/10 μL)，而BPT-CS組則鞘內注射陰性對照-siRNA(2 μg/10 μL)，BPT組則鞘內注射等體積的生理鹽水，2次/d，連續3 d。siRNA干預后9 d(MWT出現顯著改變并穩定)，使用10%水合氯醛(劑量為：0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉處死各組大鼠后，迅速取出脊髓L4～L6節段，液氮速凍后轉移至-80℃冰箱保存，用于相關指標的檢測。

1.4 MWT的檢測方法 參考文獻[9]，使用Von Frey纖維絲up-and-down法檢測各組大鼠的機械痛閾值。測量前大鼠均處于安靜狀態，測量的最小值為0.07 g，最大值為15 g，首先選擇2.0 g纖維絲垂直刺激安靜狀態下的大鼠右側后爪內側皮膚，逐漸增加力度使纖維絲彎曲成角，持續1.5 s，連續檢測3次，間隔5 min后重復檢測，以嘶吼、添足、甩尾及彈腿等任一行為發生陽性表現，然后選擇低于此力度的纖維絲繼續刺激，直至刺激出陰性表現為止；若為陰性表現則使用大于此力度的纖維絲直至出現陽性表現。以出現陽性體征的最低力度為MWT，MWT越低，疼痛程度越高。

1.5 Cx43及cAMP、PKA蛋白的檢測 取出各組標本，加入蛋白酶抑制劑的組織裂解液RIP，在冰浴中超聲勻漿，12 000 r/min離心30 min后取上清液，采用二喹啉甲酸標準蛋白測定法檢測總蛋白濃度，取40 μg總蛋白進行20%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，恒電壓100 V、2 h條件下將蛋白轉至聚偏氟乙烯膜，脫脂奶粉封閉2 h，TBST漂洗干凈后加入Cx43、cAMP、PKA(α+β)一抗(稀釋度分別為1 ∶1 000、1 ∶2 500、1 ∶200)，4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜3次，加入酶標二抗，37℃孵育2 h。TBST漂洗干凈后，在Image Lab系統下進行條帶掃描成像，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)為內參，分別以Cx43/GAPDH、cAMP/GAPDH、PKA/GAPDH條帶灰度值比值為目的蛋白相對表達量。

1.6 IL-1β和TNF-α水平的檢測 從冰箱取出脊髓L4～L6節段標本，冰浴環境下行超聲勻漿，離心10 min(4℃、2 000 g)后分別提取上清液，按照酶聯免疫吸附試劑盒說明書檢測IL-1、TNF-α水平。

1.7 統計學分析 采用SPSS 23.0軟件進行統計學分析。計量資料以(x±s)表示，比較采用單因素分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；重復測量資料比較采用重復測量方差分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同時間點5組大鼠MWT比較 骨癌痛建模后7 d大鼠MWT出現顯著變化，建立BPT模型；建立BPT模型后10 d大鼠MWT出現顯著變化，給予siRNA干預。不同組的MWT差異有統計學意義(F組間=152.744，P組間<0.001)，不同時間點間的MWT差異有統計學意義(F時間=834.561，P時間<0.001)，分組與時間無交互效應(F交互=3.475，P交互=0.067)。其中，在建立BPT模型當天(骨癌痛建模后7 d)，與假手術組比較，其余4組的MWT均下降(均P<0.05)；在建立BPT模型后1～8 d，與骨癌痛組比較，BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組的MWT均增加(均P<0.05)，但BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組組間差異無統計學意義(P>0.05)；在建立BPT模型后9 d至siRNA干預后9 d，與骨癌痛組比較，BPT-CXS組、BPT組、 BPT-CS組MWT均降低(均P<0.05)，BPT組和BPT-CS組組間差異無統計學意義(P>0.05)；在siRNA干預后6～9 d，BPT-CXS組的MWT低于骨癌痛組，而高于BPT組和BPT-CS組(均P<0.05)。見表2。

表2 5組各時間點MWT比較(x±s，g)

2.2 5組大鼠脊髓組織Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達量比較 與假手術組比較，其余4組的Cx43、cAMP、PKA蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05)；與骨癌痛組比較，BPT組、BPT-CS組和BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均升高(均P<0.05)；與BPT組比較，BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)；而BPT-CS組與BPT組之間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3及圖1。

表3 5組大鼠脊髓組織Cx43、cAMP、PKA蛋白的相對表達水平(x±s)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與骨癌痛組比較，△P<0.05；與BPT組比較，▲P<0.05。

圖1 5組大鼠脊髓組織Cx43、cAMP、PKA 蛋白表達情況

注：A、B、C、D、E分別代表假手術組、骨癌痛組、BPT-CXS組、BPT組、BPT-CS組。

2.3 5組大鼠脊髓組織TNF-α和IL-1β水平比較 與假手術組比較，其余4組的TNF-α、IL-1β水平增加(均P<0.05)；與骨癌痛組比較，BPT組、BPT-CS組和BPT-CXS組的TNF-α、IL-1β水平均增加(均P<0.05)；與BPT組比較，BPT-CXS組的TNF-α、IL-1β水平均降低(均P<0.05)，而BPT-CS組與BPT組組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

表4 5組大鼠脊髓組織TNF-α和IL-1β水平比較(x±s，pg/mg)

注：與假手術組比較，*P<0.05；與骨癌痛組比較，△P<0.05；與BPT組比較，▲P<0.05。

3 討 論

骨癌痛是復雜性疼痛，包括炎性疼痛、傷害性疼痛與神經病理性疼痛等多種性質疼痛。本研究結果顯示，骨癌痛大鼠建模后7 d，其他4組大鼠的MWT均低于假手術組(均P<0.05)，提示通過骨髓腔內注射接種鼻咽癌HONE1細胞成功建立了骨癌痛模型；隨即給予BPT組、BPT-CXS組、BPT-CS組大鼠皮下注射嗎啡，在建立BPT模型后9 d起，BPT-CXS組、BPT組、BPT-CS組大鼠的MWT均低于骨癌痛組(均P<0.05)，出現嗎啡耐受；在siRNA干預后6～9 d，BPT-CXS組的MWT低于骨癌痛組，但高于BPT組和BPT-CS組(均P<0.05)，而BPT組和BPT-CS組間差異無統計學意義(P>0.05)，這提示鞘內使用Cx43-siRNA，可以緩解嗎啡耐受現象。

既往研究表明，脊髓背角趨化因子受體CXCR4通過活化c-fos參與了骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成[10]，而上調CXCR4的表達后可以進一步激活衛星膠質細胞參與炎性疼痛[11]。因此，通過調控脊髓炎癥可能是改善骨癌痛嗎啡耐受的途徑。Cx43作為神經細胞連接蛋白之一，參與細胞間的信號轉導。研究表明，脊髓Cx43蛋白參與慢性神經病理性疼痛的維持[12]，尤其在星狀膠質細胞中，Cx43蛋白的高表達促進脊髓的炎性因子釋放[13]。沈寧等[6]研究發現，脊髓Cx43通過c-Jun氨基末端激酶通路參與了嗎啡的耐受。盡管該作者未使用骨癌痛模型進行研究，但所得結果亦提示Cx43在嗎啡耐受的發生發展中發揮了重要作用。本研究結果顯示，骨癌痛組的Cx43蛋白相對表達水平高于假手術組，且BPT組的Cx43蛋白相對表達水平高于骨癌痛組(均P<0.05)。這提示脊髓Cx43蛋白不僅參與神經病理性疼痛，脊髓組織Cx43蛋白高表達可能也是骨癌痛及BPT發生的重要機制。

cAMP/PKA是細胞經典的途徑，細胞外信號后使cAMP濃度增加，進一步上調PKA，可直接或間接調節細胞代謝。Cx43蛋白是細胞膜上重要的受體蛋白，Cx43可通過cAMP/PKA通路產生縮血管反應[14]，破壞細胞膜的完整性[15]，這提示Cx43傳遞的信號可被cAMP/PKA通路接收。本研究中，骨癌痛組的cAMP、PKA蛋白相對表達水平高于假手術組，且BPT組的cAMP、PKA蛋白相對表達水平高于骨癌痛組(均P<0.05)，即骨癌痛發生后脊髓組織中Cx43蛋白的高表達伴隨 cAMP/PKA通路的激活，而發生嗎啡耐受后，cAMP/PKA通路隨著Cx43蛋白表達的升高而進一步被激活；與BPT組比較，BPT-CXS組的Cx43及cAMP、PKA蛋白相對表達水平均降低(均P<0.05)，即抑制Cx43表達后嗎啡耐受得以緩解的同時，cAMP/PKA蛋白表達亦降低，這提示Cx43-cAMP/PKA通路可能在BPT發生中發揮重要作用。

脊髓星形膠質細胞和小膠質細胞激活后大量釋放入組織[16]，作用于神經元細胞膜，產生細胞毒性作用。值得注意的是，在神經系統中，cAMP激活后可促進小膠質細胞釋放IL-1β和TNF-α等炎性因子[17]，且嗎啡耐受時，也可導致炎性因子的增加[18]。在本研究中，骨癌痛組脊髓IL-1β和TNF-α水平高于假手術組，且BPT組的脊髓IL-1β和TNF-α水平高于骨癌痛組(均P<0.05)，而BPT-CXS組脊髓IL-1β和TNF-α水平低于BPT組(均P<0.05)，即脊髓cAMP/PKA的激活與抑制，均伴隨IL-1β和TNF-α濃度的增加與降低，推測在骨癌痛及BPT的大鼠模型中，脊髓IL-1β和TNFα等炎性因子可能是調控cAMP/PKA通路的重要代謝蛋白之一。

綜上所述，脊髓Cx43通過調節cAMP/PKA通路進而釋放促炎性因子IL-1β和TNF-α，可能是BPT發生的關鍵機制之一，而抑制脊髓Cx43表達可能是逆轉BPT現象的重要途徑。