消瘤湯對裸鼠結直腸移植癌組織中促紅細胞生成素肝細胞激酶B4及其配體EphrinB2表達的影響▲

徐宏智 曾家耀 赫 軍 江現強 夏可義 傅漢琨 陸世鋒 王宇坤 文亦磊 黃恒江 吳 磊

(1 廣西中醫藥大學研究生學院，南寧市 530001，電子郵箱：499242539@qq.com；2 廣西中醫藥大學第一附屬醫院胃腸腺體外科，南寧市 530023)

結直腸癌是消化道常見的惡性腫瘤，在惡性腫瘤中其發病率位居第三，死亡率位居第四[1]。目前，臨床上采取以手術為主的綜合方案治療結直腸癌，但療效十分有限，術后轉移和復發是影響其療效和預后的主要因素。已有研究證實，惡性腫瘤的新生血管生成是腫瘤生長和復發的必要條件[2-3]。惡性腫瘤的血管生成過程涉及多種復雜機制，有學者認為其與促紅細胞生成素肝細胞激酶(erythropoietin-producing hepatocyte kinase，Eph)B4受體及其配體EphrinB2的表達密切相關[4-5]。基于這一理論，本研究通過建立裸鼠結直腸癌模型，觀察消瘤湯對裸鼠結直腸移植癌組織中EphrinB2及EphB4蛋白表達的影響，探討消瘤湯抗腫瘤血管生成的作用，為結直腸癌的治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 無特定病原體級BALB/c裸鼠250只，雄性，體質量(20±2)g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，生產許可證編號:SCXK桂2009-0002。所有裸鼠均在廣西中醫藥大學動物飼養中心恒溫恒濕條件下飼養，墊料、飼料和飲水均經滅菌處理。

1.2 藥物 消瘤湯組成：黨參15 g、黃芪15 g、薏苡仁20 g、田七6 g、扶芳藤12 g、山慈菇15 g、紫河車6 g、半枝蓮15 g等。濃煎30 mL，生藥含量3.5 g/mL，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室，按1995年《中華人民共和國藥典》[6]中有關成藥煎膏劑制劑標準制備。貝伐單抗注射液購自北京康立特有限公司[規格：100 mg(4 mL)/瓶；生產批號：15734]。

1.3 主要試劑 二喹啉甲酸蛋白定量試劑盒購自上海碧云天公司(貨號：P0010)；Ponceau S染色液購自美國Sigma公司(貨號：P3504)。一抗：EphB4(兔多抗)購自德國CST公司(貨號：14960s)，EphrinB2(兔多抗)購自英國Abcam公司(貨號：Ab150411)，內參β-肌動蛋白(為鼠多抗)購自英國Abcam公司(貨號：ab6276)。

1.4 儀器 小型電泳槽(型號：165-8001)、基礎電泳儀(型號：164-5050)、小型轉印槽(型號：170-3930)均購自美國Bio-Rad公司，低溫冷凍離心機(型號：Fresco)購自美國賽默太飛世爾科技公司。

1.5 動物分組及人結腸癌裸鼠移植瘤動物模型的制備 將200只裸鼠按隨機數字表法分為對照組、中藥組、單抗組、復合組，各50只。另取25只裸鼠作為人結腸腫瘤標本移植的培養鼠，腫瘤標本移植的方法參照文獻[7-9]。取1例結腸癌患者的新鮮手術標本，將標本切成約1 cm×1 cm×1 cm的小植塊后移植到培養裸鼠右側肩胛區背部皮下；移植一段時間后，由于體液免疫作用，B細胞產生抗體作用于移植處，此時腫瘤體積會縮小；再經過一段時間，由于腫瘤的生長、增殖，其體積又會增大，說明腫瘤在裸鼠上成功存活，待腫塊長到約2 cm×2 cm×1 cm時被取下，再分別取小植塊經手術移植到各組所有裸鼠的回盲部結腸的漿膜層上，方法如下：碘附常規消毒3遍，作右下腹部切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉層以及腹膜，沿末端盲腸找到回盲部，切開并分離回盲部結腸漿膜層，將腫瘤組織包埋縫合固定于結腸的漿膜層中；止血，逐層縫合腹壁切口。

1.6 干預方法 移植3 d后，對照組給予蒸餾水灌胃，中藥組給予消瘤湯灌胃，單抗組在裸鼠尾靜脈予靜脈注射貝伐單抗；復合組給予消瘤湯灌胃聯合靜脈注射貝伐單抗。參照中藥藥理[10]，消瘤湯灌胃1 mL/次，3次/d，連續6周。參照《藥理實驗方法學》[11]及貝伐單抗使用說明書上針對結直腸癌的使用劑量，給予貝伐單抗5 mg/kg靜脈注射，連續6周。對照組蒸餾水灌胃1 mL/次，3次/d，連續6周。給藥6周后，各組所有裸鼠均剖取大腸，用磷酸緩沖鹽溶液洗凈大腸腫瘤組織，濾紙吸干，稱重后，分別予10%甲醛液固定及液氮保存。

1.7 免疫印跡試驗法檢測腫瘤組織中EphB4及EphrinB2蛋白表達 (1)提取總蛋白：根據試劑盒說明書，采用二喹啉甲酸法提取腫瘤組織的總蛋白，用Bradford方法測定蛋白濃度。(2)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳：根據目的蛋白的分子量，配制12%分離膠，濃縮膠濃度為5%。將待檢測EphB4及EphrinB2蛋白上樣。電泳條件為濃縮膠恒壓90 V，約20 min；分離膠恒壓160 V，電泳停止時間通過預染蛋白標記確定。(3)轉膜：于300 mA恒流，0.45 μm孔徑硝酸纖維素膜轉膜35 min；轉膜完成后采用麗春紅染色試劑對膜進行染色，觀察轉膜效果，同時做好泳道標記，準備預實驗時按照縱向泳道剪膜；封閉，將膜完全浸沒于3%牛血清白蛋白-TBST中室溫輕搖30 min。(4)免疫反應：用3%牛血清白蛋白-TBST稀釋一抗，濃度分別為EphB4 100 μg/mL、EphrinB2 1mg/mL、β-肌動蛋白1 mg/mL，室溫孵育10 min，置于4℃過夜；第2天取出膜，在室溫下孵育30 min；用TBST洗膜5次，3 min/次。二抗孵育，用5%脫脂奶粉-TBST稀釋二抗，即辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔/小鼠IgG(H+L)(1 ∶3 000)，室溫輕搖40 min；用TBST洗膜6次，3 min/次。(5)X射線膠片曝光顯影后行凝膠圖像分析。

1.8 統計學分析 采用SPSS 22.0軟件進行統計分析。計量資料以(x±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

各治療組(中藥組、單抗組、聯合組)腫瘤組織中的EphrinB2、EphB4蛋白的相對表達水平均低于對照組，且中藥組和聯合組的相對表達水平均低于單抗組(均P<0.05)，而中藥組和聯合組差異無統計學意義(P>0.05)。見表1、圖1、圖2、圖3。

表1 各組EphrinB2、EphB4蛋白相對表達水平比較(x±s，μg/L)

注：與對照組比較，*P<0.05；與中藥組比較，#P<0.05；與單抗組比較，@P<0.05。

圖1 EphrinB2在各組腫瘤組織中的表達情況 圖2 EphB4在各組腫瘤組織中的表達情況 圖3 內參蛋白在各組腫瘤組織中的表達情況

3 討 論

現代醫學認為，腫瘤的發生、轉移、復發及預后與機體的免疫功能及腫瘤組織血管生成有關[12]。惡性腫瘤的血管生成涉及各種復雜的分子機制，其中內皮細胞受體酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases，RTK)是血管生成不可或缺的調節因素。目前已知的RTK包括血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受體和各種Eph受體等。其中，VEGF被普遍認為是最重要也是作用最強大的特異性促血管生成因子。Eph受體是RTK家族中最大的成員，其配體Ephrin大部分都在細胞表面表達，Eph受體和配體Ephrin統稱為Eph家族蛋白。Eph家族蛋白包含16種受體和8種配體。由于各配體及受體的同源序列和兩者相結合的特異性，Eph受體又被分為A(A1～A10)和B(B1～B6)兩大類。目前，針對EphB4受體及其配體EphrinB2與腫瘤血管生成關系的研究已成為熱點。

惡性腫瘤的生長包括兩個不同的時期，即無血管的緩慢生長期和有血管的快速增殖期。在惡性腫瘤沒有形成新生血管之前，只能生長到1～2 mm3，且不會轉移，而在新生血管生成以后，腫瘤呈指數倍數增長，轉移的概率也隨之增加。由此可見，新生血管的形成是各種惡性腫瘤發展和轉移的前提條件。腫瘤的血管生成方式多種多樣，且其生成過程、機制也極為復雜，涉及多種分子信號[13-16]，其中EphB4/EphrinB2系統雙向信號轉導通路被認為是腫瘤血管生成的最重要分子信號之一。有學者指出，惡性腫瘤組織中EphrinB2配體通過雙向信號轉導通路與相鄰內皮細胞上的EphB4受體相結合后，促進血管內皮細胞的芽生、增殖、遷移和管腔形成，并且這種腫瘤細胞還能夠作用于宿主血管，使腫瘤細胞的黏附性降低，進而促進腫瘤細胞滲入血管，引起腫瘤的轉移[17]。Ozgür等[18]研究發現，EphrinB2、EphB4蛋白可高表達于腫瘤組織的動靜脈中，兩者通過彼此的雙向信號的調節作用，在腫瘤血管的發生及腫瘤細胞在動靜脈內皮的黏附和遷移過程中發揮重要作用。

有研究表明，EphB4/EphrinB2系統在多種惡性腫瘤組織如結直腸癌、乳腺癌、肺癌中高表達，且與腫瘤血管生成、侵襲及轉移密切相關[19]，但目前關于EphB4/EphrinB2系統所介導的信號傳導通路對結直腸癌腫瘤血管生成、侵襲、轉移的影響，及其具體的分子生物學機制的研究相對較少。劉海燕等[20]的研究表明，EphB4受體和(或)EphrinB2的表達水平升高可能促進腸道腫瘤的發生、分化和遷移，在結直腸癌發生發展過程中起重要的作用。研究顯示，使用高度選擇性抗體阻斷EphrinB2的表達，能夠顯著抑制由VEGF誘導的血管內皮細胞的遷移和脈管系統的形成，最終遏制腫瘤的生長和復發[21]。韓強等[22]的研究表明，EphB4與VEGF蛋白在直腸癌的進展中具有協同作用，推測EphB4可能通過VEGF在促進腫瘤的血管生成過程中發揮重要作用。還有研究顯示，通過抑制EphB4蛋白的表達雖然不會影響到單層培養腫瘤細胞的增殖能力，但是可以使接種在裸鼠皮下的腫瘤體積明顯縮小，并使瘤體內微血管密度減少[23]，這提示抑制劑可能是通過影響腫瘤組織內癌細胞誘導的血管募集反應來干擾瘤體內血管形成，最終遏制腫瘤的生長。因此，雖然惡性腫瘤血管形成的機制目前尚未被完全闡明，但EphB4/EphrinB2系統與腫瘤的血管生成密切相關，并且在腫瘤組織中EphB4/EphrinB2系統可通過多種機制影響腫瘤血管的生成進而影響腫瘤的生長、轉移及復發。由此推測，通過抑制腫瘤組織EphB4/EphrinB2蛋白的表達而干擾腫瘤的血管生成，或可抑制腫瘤的生長和轉移，最終達到改善腫瘤患者預后的目的。

抗腫瘤血管生成治療已經被公認為是一種有效的抗腫瘤治療的方法[24]，其中，貝伐單抗可與VEGF結合并阻斷其生物活性，從而減少惡性腫瘤微血管生成，以發揮抗腫瘤作用。惡性腫瘤的血管生成是由多種作用機制共同協作實現的，所以通過單獨阻斷某一種因子以抑制惡性腫瘤血管生成而抗腫瘤復發，很難達到預期療效[25]。目前，各種分子靶向藥物對腫瘤的治療作用已經獲得了循證醫學的證實，但是仍缺少通過中藥抑制相應靶點來治療惡性腫瘤的研究。中醫認為腫瘤是一種由于體內正虛和邪實的共同存在，內外因相互作用而產生的一種病理產物。臨床及實驗研究表明，中醫藥扶正祛邪法治療腫瘤不但可緩解臨床癥狀，改善患者生活質量，延長生存期，還可提高患者免疫力，預防腫瘤轉移與復發[26-27]。消瘤湯以黨參、黃芪、紫河車為君藥，有以益氣血、鼓舞正氣、扶正祛邪的作用，以半枝蓮、山慈菇、扶芳藤、田七為臣藥，可活血化瘀、解毒散結、驅除余邪，佐以薏苡仁健脾利濕，全方攻補兼施，氣血并重，諸藥合用共奏扶正祛邪之功[28]。本研究結果顯示，中藥組、單抗組、聯合組腫瘤組織中的EphrinB2、EphB4蛋白表達水平均低于對照組，且中藥組和復合組均低于單抗組(均P<0.05)。這提示各治療組的治療方案均可抑制結直腸癌腫瘤組織中EphrinB2、EphB4蛋白的表達，且消瘤湯和消瘤湯聯合貝伐單抗的抑制作用均強于單一的聯合貝伐單抗。由此推測，消瘤湯可通過抑制結直腸癌腫瘤組織中Ephrin B2蛋白及其配體EPHB4蛋白的表達，從而阻礙腫瘤組織的新生血管生成。因此，在行靶向治療的同時服用消瘤湯，或可以提高抗腫瘤的效果。此外，中藥組和復合組EphrinB2、EphB4蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)，提示這兩種方案的抑制作用相當。原因可能為：在聯合用藥時，消瘤湯可能起主導作用，而貝伐單抗起輔助作用，兩者雖然作用方向一致，但仍不足以達到質變的效應，從而使中藥組和復合組的療效相當。

綜上所述，消瘤湯能夠抑制EphrinB2、EphB4蛋白的表達，這為結直腸癌的臨床治療提供了新的思路和方法，EphB4及配體EphrinB2其或可成為今后治療結直腸癌的新靶點。