白藜蘆醇干預(yù)口腔炎性骨吸收作用及機(jī)理的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展

米 靖 仇麗鴻

口腔炎癥性骨吸收疾病主要包括慢性根尖周炎、牙周炎等，其共同表現(xiàn)是長(zhǎng)期存在的感染及病原刺激物導(dǎo)致組織慢性炎癥反應(yīng)，以至牙槽骨的吸收破壞，與細(xì)菌感染及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生和氧化應(yīng)激等有關(guān)。近幾年研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有治療口腔炎癥性骨吸收疾病的潛能。

一、白藜蘆醇的理化性質(zhì)

白藜蘆醇（resveratrol，Res）又稱(chēng)芪三酚，是非黃酮類(lèi)的多酚化合物，分子式為C14H12O3，相對(duì)分子質(zhì)量為228.25，性狀為白色無(wú)味針狀結(jié)晶，熔點(diǎn)在256～257℃，波長(zhǎng)365nm 的紫外光照條件下可以產(chǎn)生熒光，易溶于乙醚、甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮等有機(jī)溶劑而難溶于水，與堿性溶液如氨水等作用可顯紅色，與三氯化鐵-鐵氰化鉀可發(fā)生顯色反應(yīng)，可以利用此性質(zhì)鑒定白藜蘆醇。天然的白藜蘆醇是一種廣泛存在于葡萄、松樹(shù)等天然植物或果實(shí)中的植物抗毒素[1]。多項(xiàng)研究表明白藜蘆醇具有很多藥理作用，比如抗氧化、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和神經(jīng)保護(hù)等作用，近年來(lái)深受生物醫(yī)學(xué)界的重視。

二、白藜蘆醇治療口腔炎癥性骨吸收疾病潛在機(jī)制

1.白藜蘆醇的抗炎作用

慢性根尖周炎及慢性牙周炎病損組織中可以檢測(cè)到高水平的炎癥因子表達(dá)，包括白介素-1（interleukin-1，IL-1）、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等[2]。牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis，P.g）及牙髓卟啉單胞菌（Porphyromonas endodontalis，P.e）脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是重要致病因子，Antonietta Rizzo[3]及Zhen[4]分別用P.g-LPS 刺激人牙周膜細(xì)胞和牙齦上皮細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)細(xì)胞高水平表達(dá)IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α 等炎癥因子，而經(jīng)過(guò)白藜蘆醇作用后上述炎癥因子的表達(dá)下降；P.e-LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶-13（matrix metalloproteinase-13，MMP-13），白藜蘆醇可以抑制P.e-LPS 引起的成骨細(xì)胞MMP-13 表達(dá)和分泌[5]。LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞引起TNF-α 高表達(dá)，與不同濃度的白藜蘆醇作用后細(xì)胞分泌TNF-α 的量明顯減少并呈現(xiàn)出劑量依賴(lài)性[6]。Ma[7]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以減輕LPS 誘導(dǎo)的鼠巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)，降低IL-6的表達(dá)。除此之外，根尖周炎和牙周炎的發(fā)生發(fā)展還與IL-17 有著密切關(guān)系，Casati MZ 建立了小鼠牙周炎模型，模型組IL-17 表達(dá)量升高，白藜蘆醇處理組IL-17水平則顯著降低，但是兩組IL-1β和IL-4的表達(dá)水平?jīng)]有差異[8]。除上述炎癥因子外，白藜蘆醇還可以通過(guò)抑制Toll 樣受體（toll like receptor，TLR）如TLR-4 來(lái)抑制炎癥反應(yīng)，Liu L 等用IL-1β刺激軟骨細(xì)胞后，TLR-4 表達(dá)增高，白藜蘆醇作用后與對(duì)照組相比TLR-4 表達(dá)降低，Capiralla 等用LPS 處理小膠質(zhì)細(xì)胞后得出同樣結(jié)論[9～11]。

2.白藜蘆醇的抗氧化應(yīng)激作用

氧化應(yīng)激（oxidative stress，OS）是指在遭受各種有害刺激時(shí)，組織或細(xì)胞內(nèi)自由基的產(chǎn)生與抗氧化防御系統(tǒng)之間存在著嚴(yán)重失衡，活性氧蓄積導(dǎo)致?lián)p傷的過(guò)程。生理狀態(tài)下，機(jī)體組織內(nèi)自由基的產(chǎn)生與清除保持動(dòng)態(tài)平衡，當(dāng)自由基過(guò)度產(chǎn)生或者抗氧化防御體系功能受損時(shí)，機(jī)體將處于氧化應(yīng)激狀態(tài)[12]。氧化應(yīng)激狀態(tài)可以使炎癥因子如IL-8、TNF-α 等分泌增加，加速炎癥發(fā)展并加重牙槽骨的破壞[13，14]。Gan[15]等人發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激可以顯著降低成骨細(xì)胞活性，并呈現(xiàn)出時(shí)間依賴(lài)性，細(xì)胞的礦化能力也顯著降低，證明氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致成骨細(xì)胞功能失調(diào)。

線粒體呼吸鏈?zhǔn)钱a(chǎn)生ROS 的一個(gè)重要途徑，白藜蘆醇可以通過(guò)調(diào)節(jié)該途徑減少ROS 的生成[16]。線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ和Ⅲ是細(xì)胞內(nèi)ROS 的重要來(lái)源，白藜蘆醇可以調(diào)節(jié)復(fù)合體Ⅰ，改變線粒體NAD+/NADH 比例[17]，還可以通過(guò)與輔酶Q 競(jìng)爭(zhēng)降低復(fù)合體Ⅲ活性，不僅可以抑制ROS 的產(chǎn)生，也可以清除已經(jīng)產(chǎn)生的ROS[18，19]。

Naofumi 的實(shí)驗(yàn)證明白藜蘆醇可以通過(guò)Sirt1/AMPK 和Nrf2 抗氧化途徑來(lái)減輕鼠牙周炎模型中的氧化應(yīng)激程度，與牙周炎組相比，白藜蘆醇處理組Nrf2、HO-1、NQO-1 的mRNA 表達(dá)量升高，iNOSmRNA 表達(dá)量降低，同時(shí)牙槽骨吸收程度與對(duì)照組相比明顯緩解[20]。Rita 等人用雙氧水刺激人牙齦成纖維細(xì)胞建立氧化應(yīng)激模型，比較白藜蘆醇、槲皮素、NAC 三種藥物的抗氧化效果發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇與其他藥物相比能增強(qiáng)細(xì)胞增殖，清除絕大部分ROS，刺激Ⅰ型膠原纖維形成，調(diào)節(jié)線粒體呼吸反應(yīng)，可以作為治療氧化應(yīng)激失調(diào)的補(bǔ)充藥物[21]。ROS可以誘導(dǎo)氧化/抗氧化系統(tǒng)失衡，引起小鼠骨丟失，口服白藜蘆醇則預(yù)防了因氧化應(yīng)激造成的骨丟失[22]。Hung 等[23]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以清除體內(nèi)自由基并抑制自由基的形成，減輕DNA 的損傷。綜上所述，白藜蘆醇可以通過(guò)抑制ROS 生成及清除已產(chǎn)生的ROS，并通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)信號(hào)通路起到抗氧化的作用。

3.白藜蘆醇調(diào)節(jié)骨代謝的作用

慢性根尖周炎及牙周炎的特征性表現(xiàn)為成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞調(diào)節(jié)的骨代謝平衡被打破導(dǎo)致的牙槽骨的破壞[24]。成骨細(xì)胞是形成骨的主要細(xì)胞，起源于多能骨髓基質(zhì)的間質(zhì)細(xì)胞，白藜蘆醇可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞的分化，并且可以提高堿性磷酸酶和脯氨酰羥化酶的活性，具有劑量依賴(lài)性[25]。Patrice[26]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以促進(jìn)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)成骨細(xì)胞標(biāo)志物，如骨鈣素（osteocalcin）和骨橋素（osteopontin），表明白藜蘆醇具有促成骨作用。除此之外，白藜蘆醇還可以通過(guò)雌激素受體（E2）激活ERK 通路，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化基因如RUNX2、OCN 的表達(dá)[27]。

除了促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化外，近年來(lái)有學(xué)者發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以誘導(dǎo)牙源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。Zhang[28]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過(guò)SIRT1 來(lái)促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞及根尖牙乳頭干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，白藜蘆醇處理干細(xì)胞后成骨分化的標(biāo)志如ALP 活性、礦化能力、以及成骨相關(guān)基因（ALP、骨鈣素、骨橋素）均有不同程度的提高。

核因子κB 受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor kappa B ligand，RANKL）和骨保護(hù)素（osteoprotegerin，OPG）在破骨細(xì)胞形成過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Zhao[22]等在小鼠成骨細(xì)胞中加入金屬離子，導(dǎo)致RANKL/OPG 比值升高，而白藜蘆醇作用后與對(duì)照組相比OPG/RANKL 比值維持在正常水平，避免了金屬離子誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞形成。Mehdi[29]發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇對(duì)RANKL 產(chǎn)生抑制作用，并呈現(xiàn)出時(shí)間及濃度依賴(lài)性。值得注意的是白藜蘆醇不是簡(jiǎn)單的促進(jìn)或者抑制OPG 生成，而是維持其穩(wěn)定水平。在OPG/RANKL 降低時(shí)促進(jìn)OPG 生成，而在一些刺激因素如PGD2、PGE2 等作用在成骨細(xì)胞后引起OPG 上調(diào)時(shí)，起到降低OPG 的作用[30，31]。

綜上，白藜蘆醇不僅可以促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞及牙源性干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化，還能抑制破骨細(xì)胞的形成，發(fā)揮多種作用維持牙槽骨重建與吸收的平衡，起到保護(hù)牙槽骨的作用。

三、白藜蘆醇調(diào)控疾病相關(guān)信號(hào)通路

目前已發(fā)現(xiàn)多條信號(hào)通路參與了白藜蘆醇調(diào)控口腔炎癥性骨吸收疾病的發(fā)展，其中NF-κB、SIRT1、p38MAPK 等信號(hào)通路的作用最關(guān)鍵。這些信號(hào)通路不但自身具有較復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，而且彼此相互聯(lián)系、相互影響，從而組成了一個(gè)更復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，共同參與白藜蘆醇的調(diào)控作用。

1.NF-κB炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

核因子κB（nuclear factor-κB）是一類(lèi)炎癥相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于真核細(xì)胞內(nèi)，與炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展過(guò)程密切相關(guān)。NF-κB 被證實(shí)可以誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6、TNF-α 等）、趨化因子、粘附分子以及各種炎癥相關(guān)的酶類(lèi)持續(xù)表達(dá)，趨化炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，引起炎癥反應(yīng)[32，33]。同時(shí)上述炎性因子又可以活化NF-κB，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)。白藜蘆醇可以通過(guò)抑制NF-κB 來(lái)發(fā)揮抗炎效應(yīng)[7]。Capiralla 等[11]細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以通過(guò)干擾IKK 和IκB 的磷酸化來(lái)抑制LPS 引起的NF-κB活化。另有研究表明白藜蘆醇可以作用在TLR-4/MyD88/NF-κB 信號(hào)通路，減輕軟骨細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[10]。白藜蘆醇的衍生物也被證明可以減少LPS 引起的NF-κB 核移位[34]。

2.SIRT1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

SIRT1 是組蛋白去乙?；?，可以通過(guò)減少炎性因子的產(chǎn)生及減輕細(xì)胞的病理?yè)p傷直接抑制炎癥，也可以通過(guò)抑制下游信號(hào)通路（NF-κB、p38MAPK 等）來(lái)間接抑制炎癥[35]。白藜蘆醇是SIRT1的天然激動(dòng)劑，早在2003年就被證明其可以直接提高細(xì)胞內(nèi)SIRT1 活性，發(fā)揮抗腫瘤、抗炎等作用[36]。Pan[37]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，TNF-α 誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，白藜蘆醇作用后激活SIRT1，抑制NF-κB 及p38MAPK 表達(dá)，從而發(fā)揮保護(hù)細(xì)胞的作用。另幾項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明白藜蘆醇可以激活SIRT1 來(lái)緩解敗血癥小鼠模型急性腎損傷及心肌損傷癥狀，選擇性抑制SIRT1之后白藜蘆醇對(duì)小鼠的保護(hù)作用也被抑制了[38，39]。除此之外，白藜蘆醇可以通過(guò)上調(diào)SIRT1 蛋白表達(dá)，降低P.e-LPS 刺激的成骨細(xì)胞中NF-κB 的轉(zhuǎn)錄活性，從而抑制NF-κBp65 亞基與MMP-13 啟動(dòng)子結(jié)合，從而降低成骨細(xì)胞MMP-13 的表達(dá)[5]。最近有研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇也可以通過(guò)抑制cAMP 磷酸二酯酶間接激活SIRT1[40]。在Sadeghi[41]的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，白藜蘆醇減輕氧化應(yīng)激并抑制JNK-NF-κB 信號(hào)通路的作用不依賴(lài)于SIRT1。白藜蘆醇與SIRT1 的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

3.p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路

p38MAPK 是一種分子量約為38KD 的蛋白激酶，磷酸化后核移位，作用于多種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-1、IL-6等多種細(xì)胞因子表達(dá)，引起炎癥反應(yīng)。p38MAPK與根尖周炎的發(fā)生發(fā)展也有著密切關(guān)系[42]。白藜蘆醇與p38MAPK 信號(hào)通路的關(guān)系研究較少。Bi[43]等人發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇可以抑制LPS 誘導(dǎo)的p38MAPK 磷酸化，減少TNF-α 等炎性因子的產(chǎn)生，從而抑制炎癥反應(yīng)。其他兩個(gè)實(shí)驗(yàn)[7，37]證明白藜蘆醇可以下調(diào)p38MAPK 活性起到保護(hù)細(xì)胞的作用。

除上述炎癥信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之外，白藜蘆醇還與JAK/STAT、AMPK、SOCS-1、SOCS-3 等多種炎癥相關(guān)信號(hào)通路有關(guān)[7，44，45]。白藜蘆醇的抗炎作用及作用機(jī)制還需不斷的研究。