SSR標記技術在中藥鑒定中的應用

劉培培 羅光明，2 柴華文 張俊逸 朱梓豪 王得運

（1. 江西中醫藥大學藥學院，南昌 330004；2. 江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，南昌 330004）

中藥是我國珍貴的瑰寶，幾千年來，在人們的養生、保健以及治療疾病方面發揮著不可替代的作用。中藥材種類繁多，使用歷史悠久，來源復雜。有些藥材全國各地都可種植，然道地藥材療效最佳。一些中藥的近緣種屬極易混淆，甚至不同中藥的藥用部位極其相似，仿品和偽品也充斥其中，鑒定方法不完善導致多起安全性事件，給中藥臨床應用帶來極大挑戰［1］。中藥材是藥效的基礎，因此，必須不斷發展和完善中藥的鑒定方法，確保藥材的質量。中藥的鑒定方法從中藥藥師憑借其長期積累的經驗［2-3］對中藥形狀、顏色、氣味及重量等進行鑒定，到通過顯微鏡觀察藥材的結構、組織特征等分析其特性，以及一系列的物理化學方法對其進行定性定量分析，如高效液相色譜法、紅外光譜鑒定法、高效液相色譜-質譜分析法等，大大提高了鑒定的準確性，但仍存在一定的局限［4］。隨著計算機技術和生物技術的不斷發展，以DNA分子遺傳標記技術、細胞生物學技術、圖像分析技術及聚類分析技術等為標志的中藥鑒定新技術新方法應運而生，如隨機擴增多態性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性片段長度多態性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分子標記［5］，簡單重復序列（Simple sequence repeats，SSR）等技術，為中藥鑒定技術的發展創造了新的發展空間［6-7］。DNA分子標記技術具有微量、快速的特點［8］，更合適沒有詳細背景材料的中藥材的鑒別。分子標記具有特異性高、重復性好、結果可靠、操作簡單，對DNA要求不高等特點［9］。隨著高通量測序技術的發展，一次就可獲得大量的SSR分子標記，為藥用植物種質鑒定、遺傳圖譜構建、遺傳多樣性分析提供了有力的工具。本文是在查閱文獻的基礎上，歸納總結了SSR標記技術在中藥鑒定中的應用，旨為該技術在中藥材中的進一步研究提供理論參考。

1 SSR分子標記

新一代測序技術（Next-generation sequencing，NGS）的發展為分子標記技術提供了一個新的平臺［10］，如微衛星（Microsatellite）和微衛星標記（Microsatellite marker）。微衛星標記為分子標記的一種，微衛星標記又稱為短串聯重復序列（Short tandem repeat，STR）或簡單重復序列（SSR）［11］，指的是基因組中由 1-6 個核苷酸，如（AT）n、（AC）n、（GA）n、（AAG）n、（AAT）n、（CATG）n等組成的基本單位重復多次構成的一段DNA［12］。微衛星標記是根據微衛星標記兩側的已知序列設計擴增引物獲得擴增產物的分子標記，擴增得到的是包含微衛星標記序列在內的片段，反映的是不同微衛星標記重復次數導致的多態性，為共顯性標記［13］。由于微衛星標記位點兩端的序列保守性強，因此可以通過設計特異性引物來檢測位點的多態性［14］。根據微衛星標記的來源可將其分為基因組微衛星標記和表達序列標簽（Expressed sequence tag，EST）-微衛星標記（Simple Sequence Repeats，SSR）［15］。近年從表達序列標簽中開發出微衛星標記（EST-SSR）可以充分利用現有序列標簽數據，很大程度上降低微衛星標記引物開發的難度［16］，因其具有較好通用性且開發方法簡單、成本低等特點應用更為廣泛。

SSR分子標記具有多態性高、共顯性、易檢測、重復性高、數量豐富及對基因組有很好的覆蓋性等特點［17］。此外，SSR標記技術需要樣品量少，對物種損壞較少，通過非損傷取樣法即可獲得的大量遺傳信息，是研究珍稀瀕危植物的種群遺傳多樣性及保護種群資源的有力工具［18］。

微衛星標記技術憑借其突出的優越性，廣泛應用于植物學和農學領域中系譜分析與進化、遺傳圖譜構建、基因定位克隆、品種鑒定等方面［19-20］。目前在農作物及經濟作物中應用微衛星標記進行品種鑒定的研究較為多見，如大麥、高粱和陸地棉等。微衛星標記法鑒定品種技術規程已作為農業行業標準供參考使用［21］。國際植物品種權保護組織將微衛星標記指定為構建DNA指紋數據庫的標記方法之一，我國還根據微衛星標記指紋技術建立了玉米和水稻品種鑒定的2個行業標準［22］。SSR還用于人類基因作圖和目的基因篩選、法醫學個體識別和親權鑒定、器官移植、人類學、民族學及考古學等方面的研究［23］。這表明微衛星標記技術有其獨特的優勢。

目前，SSR標記技術在中藥中的應用雖遠遜于在植物學和農學領域，但有許多學者利用微衛星分子標記法對中藥材進行分析研究，如對中藥的種質鑒定與分析、親緣關系及遺傳多樣性分析及構建遺傳連鎖圖譜等［24］。

2 SSR標記技術在中藥鑒定中的應用

2.1 偽品的鑒定

SSR標記可用于鑒定中藥材偽品。劉艷麗［25］以豆科中藥黃芪為材料，利用SSR分子標記法對黃芪及其7種常見偽品進行了鑒別。其借用同科植物大豆的10對SSR引物，其中6對引物的結果顯示黃芪及7種偽品分別產生了長度不同、 等位基因數相異的SSR序列，這種SSR位點的長度多態性以及它們各自不同的等位基因數目顯示了它們的差異。蔣超等［26］通過EST來源的SSR引物jp.ssr4、jp.ssr64和jp.ssr65準確鑒別金銀花的原植物忍冬，可區分其和變種紅白忍冬及偽品山銀花的來源植物紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬及黃褐毛忍冬。這表明SSR標記法應用于中藥鑒別具有較好的可行性。

2.2 品種的鑒定

SSR標記可用于中藥材品種的鑒定。張利民等［27］在轉錄組測序的基礎上，分析蒙古黃芪轉錄組序列中的SSR位點，設計引物并對膜莢黃芪和蒙古黃芪進行鑒定。李清等［28］通過生物信息學手段對金釵石斛轉錄組序列進行SSR位點搜索、分析，并設計出SSR特異性引物。結果表明，金釵石斛轉錄組測序產生的Unigenes信息可作為開發SSR標記的有效來源，其中的SSR位點出現密度大、類型豐富、多態性潛能高，在金釵石斛及其近緣種的分子鑒定、遺傳多樣性與分子育種等方面具有較好的應用前景。厚毅清等［29］通過SSR分子標記技術，篩選用于黃芪與紅芪鑒定的核心引物，通過聚類分析結果確認引物的有效性和準確性，標記核心引物的特異性位點，生成鑒定圖譜代碼，為黃芪與紅芪的鑒定及遺傳分析提供依據。尹躍等［30］以16個枸杞品種為材料，利用SSR標記構建枸杞分子身份證，為枸杞品種鑒定和保護提供參考。陳子易等［31］挑選引物能擴增出可區分人參和西洋參的特異性片段，用于鑒別人參和西洋參。

2.3 種質的鑒定與分子標記輔助育種

SSR技術可用于中藥材種質的鑒定。王曉麗等［32］采用AFLP、SSR及其聚類樹對24份不同天麻種質材料的遺傳多樣性等進行分析，并對AFLP和SSR這2種分子標記進行比較，結果表明2種分子標記將天麻變型種質聚類劃分的結果相近，但SSR能將野生天麻聚在一類。這說明，天麻不同種質AFLP多態性高于天麻SSR，但SSR對野生天麻有較強的區分能力。吳素瑞等［33］利用簡單重復序列分子標記鑒別柴胡栽培種質的方法，初步形成了可鑒別選育品系的SSR特征譜帶數據。依據遺傳距離構建聚類樹圖，篩選出多態性高的引物，獲得了試驗種質的SSR特征譜帶數據，將不同品系的柴胡種質各獨自聚為一類，篩選出的引物對和建立的檢測方法可供柴胡種質鑒別參考使用。鄭紀偉等［34］基于高通量熒光 SSR 標記基因分型技術構建了 16 份含笑種質的指紋圖譜，用優選的 4 對核心引物區分 了16份含笑種質。郭麗麗等［35］利用 22個自主開發的SSR標記對來自 5個品種群的 30個牡丹種質多態性及其親緣關系進行了分析，表明該標記具有多態性，能有效鑒定牡丹種質資源的遺傳多樣性，研究結果可為探究牡丹遺傳多樣性和牡丹資源保存提供理論依據。

SSR標記可用于中藥材輔助育種。代嬌等［36］通過厚樸高通量轉錄組測序獲得的Unigene序列進行SSR位點挖掘、引物設計，挑選引物進行PCR，對含有SSR的Unigene進行功能分析發現，含SSR的Unigene與能量和氧化還原等代謝過程，以及RNA轉運、剪接體和植物激素信號轉導等通路有關。厚樸高通量轉錄組序列的SSR位點具有類型豐富、特異性強和潛能高等特點，同時SSR序列的功能分析將為厚樸基因挖掘和分子標記輔助育種提供有利的工具。李俊仁等［37］以穿心蓮轉錄組測序獲得的Unigene為對象，通過設計、篩選，獲得具有潛在多態性的SSR引物組合，有10對可以擴增出與預期大小吻合的條帶。通過基因功能注釋發現，含SSR的Unigene主要與穿心蓮的基礎代謝功能相關。結果表明，穿心蓮轉錄組中SSR位點出現頻率高、類型豐富、多態性潛能較高，同時SSR序列的功能分析也為穿心蓮功能基因的定位研究和分子標記輔助育種提供了有利參考。

2.4 地域來源鑒別

SSR標記可用于中藥材的地域來源鑒定。袁燦等［38］對川芎根轉錄組數據獲得的Unigene進行了SSR檢測，對檢測到的EST-SSR進行特征分析，利用EST-SSR引物對34個川芎資源進行遺傳多樣性分析，結果顯示收集的川芎資源多樣性較好，聚類顯示川芎資源分為兩大類，聚類結果表現出一定的地域性。王學勇等［39］對不同產地丹參樣本DNA模板的PCR篩選和條件優化，建立最新EST-SSR分子標記所選引物，所選引物對不同產地丹參居群的分子標記出現了多態性。其建立的丹參最新EST-SSR分子標記具有較高的覆蓋度和多態性，可用于不同產地丹參居群的遺傳變異分析。李敏等［40］提取4種白芍的DNA基因組，篩選隨機引物對浙白芍、亳白芍、山白芍和川白芍進行PCR擴增，并聚類分析得到山白芍與亳白芍遺傳相似性系數最高而與浙白芍的遺傳相似性系數最低。其中篩選到浙江白芍、安徽白芍和山東白芍的分子鑒定標記，經克隆和測序后，可為白芍的特異性 PCR 鑒定的引物設計打下基礎。劉玉洋等［41］從槐葉決明轉錄組數據庫中通過遺傳聚類分析，將不同地區的樣品劃分為3類，通過SSR標記鑒別出了從外觀上很難鑒別的槐葉決明和不同產地望江南的差異，發現槐葉決明、小決明和望江南種間，以及小決明和望江南種內不同地理來源之間均存在較大遺傳差異，從而為槐葉決明和望江南的種質資源分析鑒定提供依據。

2.5 遺傳多樣性的研究

遺傳多樣性分析結果是構建中藥材DNA指紋圖譜及其DNA身份證的基礎。楊雯等［42］基于IlluminaMiSeq高通量測序平臺對虎耳草屬植物混合樣本進行基因組測序，利用開發的SSR標記對虎耳草屬25種植物進行聚類分析，發現物種間關系與根據傳統形態學特征分類的結果還是存在差異的。齊琳潔等［43］對不同產地的黃芩基因組序列進行分析，篩選出擴增產物穩定性好，多態性及清晰度高的引物用于10個不同產地共50份黃芩材料的遺傳多樣性分析，表明黃芩具有較高的遺傳多樣性。林開勤［44-45］研究開發獲得15個多態性SSR標記，并成功應用SSR分子標記探明貴州杜仲的遺傳多樣性與親緣關系，為杜仲的合理保護、種質資源收集與遺傳改良提供理論依據。勵娜等［46］通過簡單重復序列分子標記探討了28個雷公藤屬植物野生居群的遺傳多樣性和遺傳結構。結果表明，雷公藤屬植物具有較高遺傳多樣性水平，植物居群間存在較高的遺傳分化。

3 小結與展望

分子標記技術被用于藥用植物分類與中藥材的鑒定研究以來，受到DNA提取困難、測序費用高昂等問題的困擾，但隨著研究的深入，高通量測序技術的飛速發展和測序成本的不斷降低，新一代高通量測序技術對中藥材全基因組范圍進行測序，產生豐富的轉錄組數據，對分子標記的發展產生了有力的推動作用。SSR分子標記已在物種鑒定、遺傳多樣性分析等方面發揮重要作用，說明分子標記技術在中藥材物種、種質資源，建立標準數據庫和分子身份證體系等方面的應用，不僅有利于中藥材的質量控制，還在中藥材種質資源保護、評價與利用以及中藥材新品種選育等領域均能發揮重要的推動作用。SSR除了作為一種分子標記外，還具有功能上的意義，如在染色體組織上的影響，對基因活性、DNA復制、細胞周期和糾錯修復系統的調節、基因功能分析等。

如今，隨著對中藥材的需求日益增加，對其中藥材鑒定的要求也會日益提高。中藥鑒定學作為中藥研究、生產制造、臨床應用等的前提保障，其對中醫藥行業的健康、持續、穩定發展具有重要意義。每一種藥材鑒定方法都存在一定的局限性，要充分了解各種鑒定方法的優勢并將其合理應用，從而對現有的方法進行合理的改進和補充。值得強調的是，在引入新技術新方法的同時，不能拋棄傳統鑒別方法，將兩者合理的結合使用，才能使中藥鑒定學得到更合理和長遠的發展。目前，分子標記技術可以對藥材的真偽、產地來源、年限、成藥等進行鑒別，但藥材品質的優劣還要依靠其他科學儀器、方法或者人工鑒別等新方法判斷。中藥分子鑒別準確、快速，但因為設備技術等條件的限制，大多在實驗室中完成。若能進一步擴大該技術的應用范圍，如藥材流通市場、藥企、藥房等，那么中藥材的準確鑒定將會更加便捷。針對這一情況，袁媛等［47］提出了中藥分子鑒別現場運用的策略，根據具體檢測對象的實際情況，為各個環節上選擇最優技術，搭建最適技術體系，用于中藥快速、現場鑒別。隨著系統生物基因組科學、代謝組學及蛋白質組學為基礎的學科的不斷完善和發展，充分運用現代計算機科學技術、仿生技術及顯微技術等為輔助，中藥鑒定技術發展將朝著更加快速、精準、便捷的方向發展。