鹽脅迫下野牛草相連分株根尖鈣離子流變化

羅 迪，羅 棟,2，錢永強，孫振元

（1. 中國林業科學研究院林業研究所 / 森林培育國家林業局重點實驗室，北京 100091；2. 廣東省深圳市福田區城市管理局，廣東 深圳 518036)）

克隆植物由各種等級的構件組成，各個構件通過連接物和間隔子進行連接，形成一個形態和生理上相連的克隆系統[1]。自然生境中資源常呈異質性分布，表現為濃度、尺度、格局和對比度上的差異[2-4]。為了適應異質生境，克隆植物通過節間連接，使光合同化物、水分、營養甚至信號分子在各克隆構件間運輸和共享，即生理整合，并通過在不同部位表型可塑性修飾[5-8]，實現物質與能量的最優分配[9-10]，從而增強了克隆植物在棲息地中的競爭力和入侵能力[11-14]。因此，與非克隆植物相比，克隆植物表現出更強的空間拓展和生態適應能力[15-17]。

生理整合是克隆植物區別于非克隆植物最主要的特征之一[18-19]。生理整合的發生是以感知異質胞外信號為前提的。因此，探索克隆植物相連分株對異質生境的應答及適應性機制，對解析克隆植物極強的生態適應性、挖掘克隆植物的應用潛力具有重要意義。野牛草(Buchloe dactyloides )是一種匍匐莖型克隆植物，可通過快速克隆生長，形成許多相對獨立或潛在獨立的克隆分株，組成不同等級的克隆構件，連成一個形態和生理上相連的克隆分株系統[20-21]，是研究克隆植物對異質生境響應、生理整合以及對克隆植物表型可塑性影響的理想材料。

眾多研究表明，Ca2+是植物生長發育必需的營養元素，同時Ca2+作為重要的第2信使，通過胞內鈣庫Ca2+的釋放及胞間Ca2+振蕩等時空動態變化，作為信號物質的同時還可以結合細胞內Ca2+受體鈣調蛋白(CaM)起作用，參與應答多種非生物脅迫，并發揮著重要的信號轉導調控機制[22-24]。

基于此，本研究對相連野牛草克隆分株設置了異質性NaCl脅迫，利用非損傷微測技術測定正常條件和NaCl脅迫下野牛草克隆片段姊妹株根尖Ca2+凈流速量的方向和變化規律，研究野牛草分株根尖Ca2+流對NaCl脅迫的響應及生理整合對相連分株根尖Ca2+流的調控作用，進而為更深入地了解克隆植物對異質生境的表型可塑性提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料培養

野牛草通過克隆生長形成許多相對獨立的克隆分株，同一匍匐莖上可以先后形成多個克隆分株，通過間隔子相連的野牛草克隆分株形成一個相對獨立的克隆片段。選取長勢良好的野牛草單株培養于中國林業科學研究院科研溫室中以獲得大量匍匐莖。將匍匐莖節點浸于純凈水中24 h，使其生根，水量以剛沒過匍匐莖為準。選取野牛草匍匐莖頂端開始數的第3株和第4株長勢一致、根長一致、生長成熟的相連克隆片段作為試驗材料。將克隆片段中較年輕的植株定義為妹株(第3株)，較老的植株(第4株)定義為姊株。

圖1 野牛草克隆分株的NaCl處理示意圖Figure 1 Buchloe dactyloides clonal fragments under NaCl stress

1.2 處理方法

1.2.1 NaCl處理

將克隆片段的相連姊妹株分別放置于兩個相鄰的、直徑為30 mm培養皿中，按處理每皿中加入20 mL相應的含NaCl或不含NaCl測試液，平衡30 min后測定離子流的變化，穩定后記錄。NaCl處理濃度為 200 mmol·L-1。共設置 4 個處理 (圖 1)，分別為，對克隆片段姊株進行NaCl脅迫處理（T1）；對克隆片段妹株進行NaCl脅迫處理(T2)；對克隆片段姊株和妹株同時進行NaCl脅迫處理(T3)；對照不進行NaCl脅迫處理(TCK)。每處理6個重復，分別測定姊株和妹株根尖Ca2+離子流。

1.2.2 LaCl3處理

將克隆片段的相連姊妹株分別放置于兩個相鄰的、直徑為30 mm培養皿中，按處理每皿中加入20 mL相應的含NaCl或不含NaCl測試液。NaCl處理濃度為 200 mmol·L-1，LaCl3處 理 濃 度 為 20 mmol·L-1，每處理6個重復，設置4個處理(圖2)。分別為，用LaCl3處理相連克隆片段姊株30 min，對姊株進行NaCl脅迫處理(TL1)；用LaCl3處理相連克隆片段妹株30 min，對妹株進行NaCl脅迫處理(TL2)；用LaCl3處理相連克隆片段的姊株和妹株30 min，對姊株和妹株同時進行NaCl脅迫處理(TL3)；用LaCl3處理相連克隆片段姊株 30 min，不進行NaCl脅迫處理(TLCK)。處理后分別測定姊株和妹株根尖Ca2+離子流。

圖2 野牛草克隆分株的NaCl和LaCl3處理示意圖Figure 2 Buchloe dactyloides clonal fragments under NaCl stress and LaCl3 treatment

1.3 離子流測定

采用非損傷微測系統(Bio-IM NMT，美國揚格公司)測定野牛草分株根系Ca2+離子流變化。測定部位為根尖分生區，距離根部頂端250 μm處。Ca2+測試液為 0.1 mmol·L-1CaCl2、0.1 mmol·L-1KCl、0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1NaCl、0.2mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 6.0；鹽脅迫處理時 測 試 液 中 再 加 入 200 mmol·L-1NaCl。 低 濃度(0.05 mmol·L-1)Ca2+校 正 液 為 0.05 mmol·L-1CaCl2、0.1 mmol·L-1KCl、0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5mmol·L-1NaCl、0.2 mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 6.5；高濃度 (0.5 mmol·L-1)Ca2+校正液為 0.5 mmol·L-1CaCl2、 0.1 mmol·L-1KCl 、 0.1 mmol·L-1MgCl2、0.5 mmol·L-1NaCl、0.2 mmol·L-1Na2SO4、0.3 mmol·L-1MES，pH 5.5。

將測定的數據代入Fick第一擴散定律公式，計算 Ca2+流動速率[單位為 pmol·(cm2·s)-1]。公式如下：

J = -D·dc/dx。

式中：J為電極移動方向的離子流；dx為電極移動距離，dc為電極移動的兩點間的離子濃度差，D為測定離子的擴散常數。離子流速計算結果為正值時表明Ca2+流出細胞(外流)；計算結果為負值時表明Ca2+流入細胞(內流)。

1.4 數據分析

利用單因素方差分析方法對各處理間姊株和妹株的Ca2+流差異進行分析，并用Duncan檢驗進行多重比較；利用獨立樣本T檢驗的方法比較相同處理下姊株和妹株間的Ca2+流差異；采用SPSS 16.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統計軟件進行分析。

2 結果

2.1 姊妹克隆分株根尖Ca2+流對NaCl脅迫的響應

各處理姊株根尖Ca2+凈流量均呈現外流的狀態(圖3)。與對照(CK)相比，NaCl脅迫下(T1、T2和T3)姊株根尖的 Ca2+凈外流量顯著增加 (P＜0.05)，但各NaCl脅迫處理間姊株根尖Ca2+凈流量并無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

與姊株根尖離子流結果相似，各處理妹株根尖的Ca2+凈流量也均呈現外流的狀態(圖3)。與對照(CK)相比，單獨對妹株進行NaCl脅迫(T2)和同時對姊妹株進行NaCl脅迫時(T3)顯著提高了妹株根尖 Ca2+凈外流量 (P＜0.05)。而單獨對姊株進行NaCl脅迫時(T1)，妹株根尖Ca2+凈流量并無明顯變化 (P ＞ 0.05)(圖 4)。

圖3 野牛草姊株和妹株根尖Ca2+凈流量對NaCl脅迫的響應Figure 3 Ca2+ net flux responses of older and younger ramet root tips of Buchloe dactyloidesunder different NaCl treatments不同小寫字母表示不同處理間差異顯著(P＜0.05)。圖5同。Different lowercase letters indicate significant differences among different treatments at the 0.05 level; similarly for Figure 5.

圖4 野牛草姊妹株根尖Ca2+凈流速在相同NaCl脅迫下的差異Figure 4 Differences between Ca2+ net flux of older and younger ramet root tips of Buchloe dactyloides under the same NaCl stress*和**分別表示相同處理下姊妹株間差異顯著(P＜0.05)或極顯著 (P＜0.01)。圖 6 同。* and ** indicate significant differences between older and younger ramets under the same treatment at 0.05 and 0.01 levels, respectively;similarly for Figure 6.

2.2 相同NaCl脅迫下姊株和妹株根尖Ca2+流比較

對照(TCK)的姊株和妹株根尖Ca2+凈流量無顯著差異 (P ＞ 0.05)(圖 5)。單獨對姊株進行 NaCl脅迫時(T1)，姊株根尖Ca2+凈外流量顯著高于妹株(P ＜0.05)。單獨對妹株進行NaCl脅迫時(T2)，妹株根尖Ca2+凈外流量顯著高于姊株(P＜0.05)。對姊株和妹株同時進行NaCl脅迫時(T3)，妹株根尖Ca2+凈外流量顯著高于姊株(P＜0.05)。

2.3 姊妹克隆分株根尖Ca2+流對LaCl3的響應

LaCl3處理后，姊株根尖Ca2+仍呈現外流狀態，各處理間差異并未達到顯著水平 (P ＞ 0.05)(圖 6)。LaCl3處理后，妹株根尖Ca2+仍呈現外流狀態，各處理間差異也并未達到顯著水平(P ＞ 0.05)(圖5)。加入LaCl3后，姊株和妹株根尖Ca2+外流均增加，且與未加LaCl3處理對比差異達到極顯著水平 (P＜0.01)(圖 6)。

3 討論與結論

非損傷微測技術 (non-invasive micro-test technique,NMT)也稱無損微測技術，是一種選擇性離子和分子檢測技術[25-27]。它利用特異性離子或者分子選擇性電極，在不損傷樣品的基礎上，測定多種離子和分子進出活體樣品的流速、流量和流向，且具有極高的精準度。非損傷微測技術在直接獲取組織或細胞外部分子和離子的信息方面具有明顯優勢，目前已被廣泛應用于生命科學的諸多領域[27]。

研究表明NaCl脅迫會引起植物細胞Ca2+濃度的升高[28]。植物細胞質膜和內膜系統上的鈣離子通道調控NaCl脅迫誘導Ca2+濃度升高。本研究中，野牛草姊株和妹株根尖Ca2+凈流量在所有處理中均呈現外流狀態，Ca2+外流主要通過位于質膜上的電壓依賴型鈣泵完成。即當膜電位去極化或超極化時，鈣泵被激活，Ca2+外流[28]。

NaCl脅迫會導致克隆植物的不同構件對資源的吸收產生差異，從而使分株間形成資源的生理整合[15]。生理整合的發生以感知生境異質信號為前提，而生理整合所引起的表型變化也是以信號調控為基礎的。野牛草克隆分株可以感知NaCl脅迫信號，引起克隆分株根尖Ca2+發生變化。不同生理整合條件下的克隆分株根尖Ca2+流存在差異。生長在正常營養條件下的姊株和妹株根尖Ca2+外流流速差異不明顯。當對姊株進行NaCl脅迫時，姊株感受到脅迫，Ca2+外流迅速增加，根據“收益-成本”原則[29]，姊株并沒有馬上將脅迫信號傳遞給妹株，因而妹株Ca2+外流變化不明顯。當對妹株進行NaCl脅迫時，妹株Ca2+外流迅速增加，同時妹株將脅迫信號傳遞給姊株，共同對脅迫作出響應，姊株Ca2+外流也迅速增加，妹株Ca2+流速顯著高于姊株。當姊株和妹株均受到NaCl脅迫時，姊株和妹株Ca2+外流均迅速增加，且妹株Ca2+流速顯著高于姊株。野牛草姊妹株間存在NaCl信號的整合，調控了NaCl脅迫下野牛草分株根尖Ca2+流的變化。

圖5 野牛草根尖Ca2+凈流速對LaCl3脅迫的響應Figure 5 Ca2+ net flux responses of Buchloe dactyloides root tips to different LaCl3 treatments

圖6 LaCl3對野牛草根尖Ca2+凈流速的影響Figure 6 Effects of LaCl3 on Ca2+ net flux of Buchloe dactyloides root tips

LaCl3阻斷了Ca2+通道，阻止分株間Ca2+的運輸。存在營養生理整合的克隆分株用LaCl3處理后雖然會引起根尖Ca2+外流增加，但各NaCl脅迫處理下Ca2+外流與對照相比差異均不顯著。LaCl3阻斷了分株間Ca2+的運輸，NaCl脅迫信號不能被克隆分株根尖所感知并在分株間轉導。這證明，Ca2+參與克隆分株對異質營養的感知和應答，調控了克隆分株間的營養生理整合。