青海地區產共軛亞油酸乳酸菌分離及其對青貯全株玉米品質的影響

陳麗娟，張正友，蔡曉劍，張云華

（1. 安徽農業大學動物科技學院，安徽 合肥 230036；2. 青海大學農林科學院土壤肥料研究所，青海 西寧 810016；3. 安徽農業大學資源與環境學院，安徽 合肥 230036）

共軛亞油酸 (conjugated linoleic acid，CLA)是指含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸同分異構體的混合物的天然活性物質，該類物質具有抗癌、預防心血管疾病、減脂等功能作用[1-3]，其中c9，c11-和c10，c12-兩種異構體在CLA的生物學功能中具有重要作用[4-5]。CLA來源主要有人工合成和生物體天然合成兩種，人工合成CLA含有c9，c11-和c10，c12-兩種活性異構體含量較低，同時人工合成存在環境污染及成本較高問題，因此人工合成CLA難以推廣使用；而乳制品中c9，c11-可占總CLA含量的73%～93%，牛肉中c9，c11-占總CLA的比例為57%～85%[6-7]。目前人類主要通過攝取反芻動物畜產品牛奶、牛肉等食物來獲取部分CLA，但這些天然畜產品中CLA的含量達不到人體理想的需求量[8-10]。因此，研究如何提高畜產品中CLA含量對提升畜產品的品質具有十分重要的科學與實際意義。

畜產品中CLA的含量受動物機體內源酶、消化道微生物作用以及飼料組成成分的影響[11-14]。不同動物體內CLA內源酶的合成或酶活性存在一定的差異，在短時間內很難得以提高。動物消化道存在各種有益的微生物，其中一些微生物參與CLA的合成，但在消化道這樣一個穩定的內環境中，很難通過改變某類微生物含量來提高其CLA產量。因此，在飼糧中通過外源添加CLA提高畜產品中的CLA含量具有一定可行性。在母豬飼糧中添加1% CLA，其背部最長肌中CLA的含量顯著增加[15]。ISMAIL M M 等[16]利用含有CLA 的飼草每日飼喂奶牛，發現奶牛的生產胎數和產奶量顯著提高，同時牛乳中CLA含量也顯著增加，有效改善了牛奶品質。但由于純化CLA的價格昂貴，作為飼料添加劑，CLA在實際生產中很難大量使用。研究表明，外源微生物可以有效利用飼糧中的亞油酸、亞麻酸等不飽和脂肪酸為底物進行氫化合成CLA[17-18]。因此，利用產CLA的菌株作為青貯菌劑進行青貯以提高青貯飼料的CLA含量，從而提高畜產品的CLA含量是一個切實可行的途徑。

青貯飼料微生物共生體系中，乳酸菌數量和種類最多，是影響青貯品質的關鍵因素之一[19-20]，同時乳酸菌可以利用細胞膜上亞油酸異構酶高效率轉化亞油酸獲得CLA而被廣泛關注[21-22]。這些產CLA的乳酸菌株多來自于泡菜、奶制品、青貯飼料及人和動物的腸道微生物中。Renes等[23]與方麗等[24]分別從傳統的泡菜中分離得到產CLA的植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)和鼠李糖乳桿菌(L.rhamnosus)。劉春曉[25]從傳統發酵奶油中分離出產CLA的干酪乳桿菌(L. casei)和副干酪乳桿菌(L.paracasei)。杜波等[26]從玉米(Zea mays)青貯飼料中分離出1株產CLA的植物乳桿菌。Dahiya和Puniya[27]從人糞便中分離得到多株產CLA乳酸菌?？梢娎卯aCLA乳酸菌作為青貯菌劑既可以保證青貯品質又可以提高青貯飼料中CLA的產量。此外，相關研究表明，青貯飼料青貯效果與青貯菌劑的適應特性有一定相關性[28]，青海高原地區處于高寒環境，篩選適合該地區環境產CLA的微生物將有助于提高當地青貯飼料的品質和生產效率。

1 材料與方法

1.1 青貯樣品及青貯原料

青貯原料為全株玉米，由青海春源畜牧有限公司種植并提供，在乳熟后期收割后使用錘片式粉碎機粉碎至2～3 cm待用。經過測定，全株玉米原料的干物質 ( dry matter，DM )含量為 28.83%，粗蛋白 ( crude protein，CP )含量為 8.98%，中性洗滌纖 維 ( neutral detergent fiber， NDF ) 含 量 42.19%，酸 性 洗 滌 纖 維 ( acid detergent fiber，ADF) 含量24.05%，粗脂肪 ( ether extract，EE )含量 3.76%。

1.2 培養基

MRS 培養基：蛋白胨 10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏 5.0 g、檸檬酸氫二銨 2.0 g、葡萄糖 20.0 g、吐溫 80 1.0 mL、乙酸鈉 5.0 g、磷酸氫二鉀 2.0 g、硫酸鎂 0.58 g、硫酸錳 0.25 g、瓊脂 18.0 g、蒸餾水1 000 mL、pH 6.2～6.6，121 ℃ 滅菌 15 min。

試劑：亞油酸(LA)和共軛亞油酸(CLA)分別購自Sigma公司；DNA和RNA提取試劑盒購自Invitrogen；細菌通用引物為上海生工合成，其他常規試劑均為國產或進口分析純。

1.3 菌株初篩

取自然青貯全株青貯樣品200 g，通過四分法將樣品縮小至10 g后，將其投入到無菌的燒瓶中，加500 mL無菌生理鹽水，充分攪拌后靜置30 min，利用無菌紗布將該生理鹽水過濾到另一無菌燒杯中，并按10倍稀釋法將過濾后的液體進行等梯度稀釋。隨后分別從每個梯度洗脫液中吸取適量液體放置于MRS培養基上，并涂均勻。37 ℃培養72 h后，挑選單個菌落進行平板劃線分離，直至出現完整的單菌落并保存該菌株。

1.4 菌株復篩

產CLA微生物以亞油酸為底物將其轉化為CLA，CLA在233 nm處的紫外區有特征吸收峰，因此用紫外分光光度計在該波長下掃描檢測樣品，在233 nm處有特征吸收峰即表明被檢查樣品中含有CLA，暗示接種到培養基中的菌株具有將亞油酸轉化為CLA的功能，即可確認該菌具有產CLA的能力。

將初篩所得菌種按5%接種量接種于10 mL含有亞油酸的MRS液體培養基中，培養基中亞油酸濃度為0.5 g·L-1。以不接入菌種、其他條件相同的發酵培養液為空白對照，37 ℃靜置培養 72 h，使用紫外可見分光光度計(SP-756)在波長233 nm進行掃描。

1.5 菌株鑒定

形態學鑒定：采用稀釋平板法，在MRS培養基中培養獲得單菌落，取生長良好的菌落，在菌落表面滴幾滴3%的戊二醛固定液在4 ℃下固定2 h。用DEPC水浸泡過的鐵勺輕刮菌體于滅菌過的 2 mL 離心管，10 000 r·min-1離心 2 min 后換入新的3%戊二醛固定4 h。將固定后的菌體加入0.1 mol·L-1的PBS 緩沖液 (pH 7.2，下同)中，清洗3遍，每次 20 min。用30%、50%、70%、80%、95%、100% 共6種濃度的乙醇溶液對樣品進行脫水處理，每種濃度在4 ℃下處理20 min，置換到100%丙酮(或乙酸異戊酯)中，4 ℃，兩次，每次20 min。臨界點干燥處理，鍍膜，掃描電鏡觀察其表面形態變化。

分子生物學鑒定：參照CTAB法提取，提取菌株中總DNA。以提取的菌株DNA為模板，細菌16S rDNA通用引物為27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'進行擴增。反應體系：Taq DNA Polymerae (5 U·μL-1)為 0.25 μL；5 × Taq Buffer為 10 μL；dNTP 為 1 μL；模板為 2 μL；上下游引物各2 μL；ddH2O補至50 μL。細菌反應條件：94 ℃ 預變性 5 min；94 ℃ 變性 45 s，55 ℃ 退火 1 min，72 ℃ 延伸 1 min，35 個循環；72 ℃延伸10 min；4 ℃保溫。PCR擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，檢測合格后用2%的瓊脂糖凝膠回收目的條帶，使用膠回收試劑盒純化后，送至上海生工測序。利用NCBI網站的在線Blast軟件對進行同源性對比。

1.6 全株玉米青貯處理

青貯試驗共設置5個處理，對照組不接種青貯菌劑(接種量為0)，不產CLA的植物乳桿菌設置兩個濃度 (LP-1：接種量為 1 × 105cfu·g-1；LP-2：接種 量 為 1 × 106cfu·g-1)， 產 CLA 的 植 物 乳 桿菌ANCLA2分別設置兩個濃度(ANCLA2-1：接種量為1 × 105cfu·g-1；ANCLA2-2：接種量為1 × 106cfu·g-1)，每個處理3個重復，分別裝入2.5 kg的厭氧發酵袋中，抽真空，密封，室溫保存40 d。

1.7 樣品采集及分析

飼料樣品采集：開袋后將樣品充分混合，采用四分法采集全株測定飼料中營養物質的含量。全株玉米青貯后根據氣味、pH、色澤和質地等方面進行感官評價，隨后測定乳酸 ( lactic acid，LA)、乙 酸 (acetic acid，AA)、 丙 酸 (propionic acid，PA)和 丁 酸 (butyric acid，BA)及 氨 態 氮(ammonia nitrogen，NH3-N)含量、干物質、粗脂肪、粗蛋白、中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維和共軛亞油酸。

感官評價指標：參考重慶地方標準DB-50T 669-2016青貯飼料品質鑒定，根據青貯的氣味(1-25分)、質地 (1-10分)、pH(1-25分)、色澤(1-20分)和水分(1-20分)進行評分。綜合5項得分，評定為優等(100-72分)、良好(71-37分)、一般(36-11分)和劣質(≤ 10分)4個等級。

LA含量和揮發性脂肪酸(AA、PA和BA)及NH3-N含量測定：參照張亞格等[29]的方法對樣品進行測定前制備，參照張淑枝等[30]的方法測定LA含量，參照Shao等[31]的方法采用高效氣相色譜儀(Agilent 1260)測定揮發性脂肪酸含量，參照Weatherburn[32]的方法采用苯酚－次氯酸鈉比色法測定NH3-N含量。

采用索氏抽提法測定EE含量，采用凱氏定氮法測定CP含量，在范氏法(Van Soest)的基礎上使用濾袋分析法測定NDF和ADF含量，使用pH計測定pH。

CLA測定：以正己烷為溶劑，將CLA標準品配成不同濃度的溶液，以正己烷為參比，在233 nm處測定其吸收值，以CLA的質量濃度 (pg· mL-1)為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制標準曲線。發酵液中CLA的提取及測定按薛秀恒等[33]的方法操作。將所獲得脂肪酸提取物用5 mL正己烷溶解，以不接種的發酵液提取物為參比，測其吸收值，根據標準曲線計算發酵液中CLA的含量。

1.8 數據統計與分析

采用SPSS 17.0軟件對所測數據統計分析，用平均值和標準誤表示測定結果，分別對不同菌劑處理進行單因素方差分析，并用Duncan法對各測定數據進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 菌株形態學和分子生物鑒定

菌株在MRS固態培養基中培養48 h后，菌落凸起，表面光滑，呈圓形，乳白色(圖1A)。掃描電鏡觀察分離菌株呈現桿狀，兩端為圓形，無芽孢(圖1B)。根據《伯杰細菌鑒定手冊》[34]，初步鑒定該菌屬于桿菌細菌。菌株16S rDNA測序結果在NCBI中進行同源性比較分析，發現該菌株16 S rDNA 與 L. plantarum strain 10CH 的 16S rDNA 相似度為98%。分子生物學鑒定結果與形態學觀察結果一致，確定該菌為植物乳桿菌，命名為ANCLA2。

圖1 ANCLA2菌株形態學鑒定Figure 1 Morphological identification of the ANCLA2 strainA：ANCLA2 菌落在MRS中形態特征；B：ANCLA2掃描電鏡形態特征。A： The colony characteristics of the ANCLA2 strain on the MRS；B：The structure characteristics of the ANCLA2 strain in the SEM.

2.2 ANCLA2處理對全株玉米青貯感官品質影響

試驗主要從色澤、氣味、水分和質地4個方面對對照組和試驗組全株玉米進行感官評定(表1)。對照組香味較弱，刺鼻味，有微褐色存在，呈濕潤狀態，結構清晰，等級為良好。試驗組LP-1、LP-2、ANCLA2-1和ANCLA2-2青貯料顏色均呈現有光澤綠色，均有芳香酒酸味，呈蓬松、濕潤狀態，質地清晰，結構保持良好。但LP-2組綠色略強于LP-1組，同樣ANCLA2-2組綠色略強于ANCLA2-1組，試驗組的pH均低于對照組。綜合評分試驗組均高于對照組，試驗組均在優質范圍內，對照組在良好級別。

表1 ANCLA2處理對全株玉米青貯感官品質影響Table 1 Effect of ANCLA2 on organoleptic properties of whole corn silage

2.3 ANCLA2處理對全株玉米青貯品質影響

青貯40 d之后，ANCLA2-2組乳酸含量顯著高于 ANCLA2-1 處理組 (P＜0.05)，同時 LP-2 處理組乳酸含量顯著高于LP-1組(P＜0.05)，對照組乳酸含量最低，處理組間ANCLA2-2組的乳酸含量高于LP-2組，但差異不顯著(P ＞ 0.05)(表2)。乙酸含量 ANCLA2-1 組產量顯著高于其他組 (P＜0.05)，對照、LP-1、LP-2和ANCLA2-2組之間無顯著差異(P ＞ 0.05)。對照組和ANCLA2-1組丙酸含量顯著高于其他組 (P＜0.05)，ANCLA2-2 和 LP-2 處理組的丙酸含量顯著低于其他處理組(P＜0.05)，但ANCLA2-2 和 LP-2 處理組間差異不顯著 (P ＞ 0.05)。對照組檢測到微量丁酸，其他組無丁酸產生。對照組氨態氮占總氮比顯著高于試驗組(P＜0.05)，試驗組LP-1氨態氮占總氮比顯著高于LP-2組(P ＜0.05)，ANCLA2-1氨態氮占總氮比顯著高于ANCLA2-2組 (P＜0.05)，LP-1 和 ANCLA2-1 組間氨態氮占總氮比差異不顯著 (P ＞ 0.05)，LP-2 和 ANCLA2-2組間氨態氮占總氮比差異不顯著(P ＞ 0.05)。

2.4 ANCLA2全株玉米青貯營養成分影響

全株玉米青貯后，對照組干物質含量顯著高于試驗組 (P＜0.05)，LP-1 和 LP-2 處理組干物質含量差異不顯著 (P ＞ 0.05)，ANCLA2-1 處理組干物質含量顯著高于 ANCLA2-2 (P＜0.05)，ANCLA2-2 處理組干物質顯著低于 LP-1和 ANCLA2-1 組 (P＜0.05)(表3)。ANCLA2-2和LP-2處理組粗蛋白含量無顯著差異 (P ＞ 0.05)，但顯著低于其他處理組 (P ＜0.05)。對照組NDF含量顯著低于試驗組(P ＜0.05)，ANCLA2-1處理組NDF含量顯著高于其他3個試驗組(P＜0.05)，其他3個試驗組間無顯著差異(P ＞ 0.05)。對照組ADF含量顯著低于其他處理組(P＜0.05)，試驗組之間ADF含量無顯著差異(P ＞ 0.05)。ANCLA2-2 處理組粗脂肪含量顯著高于其他處理組(P＜0.05)，試驗組粗脂肪含量顯著高于對照組 (P＜0.05)，LP-1 和LP-2 組粗脂肪含量差異不顯著(P ＞ 0.05)。對照組CLA含量顯著低于其他試驗組(P＜0.05)，ANCLA2-2組CLA 含量顯著高于其他處理組 (P＜0.05)，LP-1 和 LP-2 間無顯著差異 (P ＞ 0.05)。

表2 ANCLA2處理對全株玉米青貯發酵品質影響Table 2 Fermentation sensory quality of whole corn silage

3 討論

青貯菌劑是制作優質青貯飼料的保證，但目前青貯菌劑的添加主要是為了促進發酵，提高乳酸濃度、迅速降低青貯料pH，抑制丁酸和氨態氮的生成[35-36]，而在具有普通青貯菌劑功能的基礎上挖掘具有特定功能性青貯菌劑可為新型畜產品飼料的開發提供新方向。杜波等[26]從南方青貯飼料中分離到一株產CLA菌株，該菌株具有較好的產CLA能力。但在以畜牧為主產業的青海地區，由于環境溫度較低，外源菌劑難以適應高寒環境，導致飼料青貯后在短時間內不易使溫度上升到30 ℃。而如果短時間內青貯溫度達不到微生物生長繁殖的要求，一些腐敗菌就會快速繁殖，從而影響青貯飼料品質[37-38]。因此，分離適應青海高寒地區的產CLA青貯微生物具有重要意義。本研究從青海高寒地區自然青貯玉米中成功分離得到產CLA植物乳桿菌ANCLA2。用該菌反接回全株玉米中青貯后，青貯玉米的pH低于對照組，感官評定屬于優質，而對照組屬于良好。青貯中pH的高低與乳酸、乙酸及丙酸含量有一定相關性，試驗結果表明全株玉米接種ANCLA2菌后，青貯中乳酸含量提高，丙酸含量顯著低于對照組，但乙酸含量除ANCLA2-1組高于其他組，其他各組之間無顯著差異。這與Srigopalram等[39]將乳酸菌接種到意大利黑麥草(L. multiflorum)青貯后，青貯料pH顯著降低結果相似。Xu等[40]利用L. brevis和 L. parafarraginis青貯玉米秸稈，青貯pH顯著降低，乙酸含量增加。氨態氮和丁酸的生成與pH的高低有一定相關性。賈婷婷等[41]將植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌和布氏乳桿菌(L. buchneri) 3種乳酸菌分別接種到燕麥(Avena sativa)中青貯，燕麥青貯飼料的pH、丙酸和氨態氮含量顯著低于對照組。侯建建等[42]利用高濃度植物乳桿菌處理的苜蓿(Medicago sativa)青貯飼料表現出高乳酸，低氨態氮，低pH，與本研究表現一致。本研究結果顯示，試驗組ANCLA處理組和LP處理組的氨態氮和丁酸的含量均低于對照組，試驗組中有害微生物得到有效抑制。

表3 產CLA乳桿菌菌劑處理對全株玉米青貯營養成分影響Table 3 Fermentation quality of whole corn silage

本研究中試驗組LP-1和ANCLA2-1處理組粗蛋白含量低于對照組，但無顯著差異(P ＞ 0.05)，隨著菌體LP和ANCLA2接種量增加，試驗組粗蛋白含量顯著低于對照組(P＜0.05)。主要是青貯過程中由于微生物需要營養(如能量和蛋白質等各種物質)來維持自身的生長，會導致青貯原料中糖、淀粉和蛋白等營養物質的損失，而菌體蛋白的增長量不足以彌補青貯原料蛋白損失，導致青貯后蛋白含量降低[36]。Sucu等[43]報道，玉米青貯后蛋白含量降低，與本研究結論相似。但Hoffman和Funk[44]在研究青貯時間和接種量對玉米蛋白質的影響報道中發現，青貯后蛋白含量無顯著差異(P ＞ 0.05)。不同研究的青貯后蛋白質變化差異可能與青貯原料，青貯時間，菌種種類及接種量等有關。玉米等農作物秸稈的主要組成是纖維素、半纖維素和木質素，其中木質素將纖維素和半纖維素層層包裹，同時纖維素的基本組成單位是纖維二糖，因此，青貯后纖維含量的降低就存在青貯微生物分泌相關的纖維降解酶對相關纖維進行降解。侯美玲等[45]報道，乳酸菌也可顯著降低試驗組中牧草的NDF和ADF含量。但本研究中，青貯前后中性洗滌纖維，酸性洗滌纖維均顯著性高于對照(P＜0.05)，可能是由于本研究中全株玉米干物質損失量高于纖維的降解。

青貯前后粗脂肪含量的變化主要是由于參與青貯微生物能夠利用系統中營養物質合成粗脂肪，王啟芝等[46]報道，米曲霉可以提高玉米秸稈青貯后粗脂肪含量，同樣本研究ANCLA2處理組中粗脂肪含量顯著高于對照組(P＜0.05)，可能與青貯后干物質降低、同時ANCLA2菌促進粗脂肪的合成有關。ANCLA2處理組的CLA含量顯著高于對照組和LP處理組(P＜0.05)，主要是全株玉米中存在大量的不飽和脂肪酸，ANCLA2菌株可以利用該不飽和脂肪酸進行CLA轉化，從而提高了青貯后CLA含量。

4 結論

從青海地區青貯飼料中選育獲得產CLA的細菌為植物乳桿菌，并被命名為ANCLA2。從感官角度評價該菌青貯全株玉米效果和常規植物乳桿菌青貯效果相當，能有效提高青貯飼料中的乳酸和乙酸含量，降低青貯飼料的pH且抑制了青貯飼料中的氨態氮含量；但ANCLA2菌較高程度地降低了全株玉米干物質含量，且隨著接種量增加，干物質損失量提高；ANCLA2菌青貯后全株玉米粗蛋白含量降低，NDF含量顯著高于對照組和LP處理組，ADF含量高于對照組，粗脂肪和CLA含量高于其他處理組。ANCLA2菌在保證全株玉米青貯效果的同時，能提高粗脂肪和CLA含量。