60Co-γ輻照對不同胡麻品種種子萌發(fā)及幼苗生長的影響

趙東曉，王向譽，孫景詩，董亞茹，施新琴，郭洪恩

（山東省蠶業(yè)研究所，山東 煙臺 264002）

胡麻(Linum usitatissimum)即油用亞麻，一年生草本植物，有較強的耐旱、抗寒和耐瘠薄能力。在我國，胡麻主要分布在西北、華北等地區(qū)，是北方地區(qū)重要的油料作物，也是干旱及半干旱地區(qū)的主要經(jīng)濟作物[1]。胡麻籽粒含油量高達36.5%～49.5%，僅次于花生(Arachis hypogaea)，而高于向日 葵 (Helianthus annuus)、 大 豆 (Glycine max))、 大麻(Cannabis sativa)等作物[2]。胡麻油是一種優(yōu)質(zhì)的食用油，富含人體所必需的α-亞麻酸、油酸和亞油酸等不飽和脂肪酸，具有抗癌、預(yù)防心腦血管疾病、增強免疫力等醫(yī)療和保健功能[3]。同時胡麻油易吸收氧氣而迅速干燥，是一種典型的干性油，目前已在工業(yè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用[4]。胡麻種皮中木酚素含量豐富，木酚素被認為是一種植物雌激素，其結(jié)構(gòu)與人體雌激素十分相似，具有抗腫瘤生成、抗動脈硬化、預(yù)防糖尿病、抑制芳香酶活性、抗病毒、抗真菌等多種功效，在食品、臨床醫(yī)學(xué)和化妝品領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5]。此外，胡麻籽粒中富含亞麻膠，是食品、醫(yī)藥、輕紡等行業(yè)不可缺少的重要原料之一[6]。胡麻種皮中的果膠質(zhì)占6%～10%，果膠質(zhì)是一種優(yōu)良的粘合劑，可當作食品添加劑、化妝品原粉、醫(yī)藥原料等[7]。

與傳統(tǒng)育種相比，輻射誘變育種具有方法簡單、安全、突變率高、突變譜寬、后代性狀穩(wěn)定、育種周期短、增強抗逆性等優(yōu)點[8]，能在較短時間內(nèi)育成新品種，是作物品種改良的重要途徑之一[9]。目前在植物育種中被廣泛應(yīng)用。其中60Co-γ輻照是輻射誘變育種最常用的方法之一[10]。近年來，60Co-γ輻照方法已在諸多花卉、農(nóng)作物、牧草中有研究和利用。烏拉爾甘草(Glycyrrhiza uralensis)種子經(jīng) 100 Gy 和 300 Gy60Co-γ射線輻照后在 NaCl脅迫下的萌發(fā)率提高[11]。低于 200 Gy60Co-γ輻照劑量可促進木槿(Hibiscus syriacus)種子發(fā)芽，低于100 Gy輻照能提高木槿幼苗成活率[12]。楊先泉等認為輻照對馬鈴薯(Solanum tuberosum)的影響主要是損傷和抑制效應(yīng)，輻照降低出苗率、推遲出苗期、延長出苗持續(xù)期，品種(系)間存在敏感性差異[13]。Flores等[14]通過60Co-γ的誘導(dǎo)突變，獲得了抗枯萎病的黃果西番蓮(Passiflora caerulea)。60Co-γ可去除水稻(Oryza sativa)、花生的真菌污染[15-16]。60Co-γ射線輻照處理可提高黑麥草(Lolium perenne)分蘗數(shù)、株高和鮮質(zhì)量[17]。張彥芹等[18]用60Co-γ輻射高羊茅(Festuca arundinacea)，在植株形態(tài)性狀和耐旱(寒)性狀上均發(fā)生了明顯變異，并獲得了葉片變小、變細且具有耐旱(寒)特性的高羊茅突變體。研究表明 20～40 Gy60Co-γ輻照劑量可以改善德國鳶尾(Iris germanica)種子萌發(fā)率，60～80 Gy可以作為德國鳶尾雜交種子的誘變劑量[19]。用60Co-γ射線處理樹蘭(Aglaia odorata)蒴果，對樹蘭再生植株的影響明顯，對株高、葉長影響最大，葉片數(shù)量次之，葉寬最小[20]。耿興敏等[21]以不同劑量的60Co-γ射線對7個桂花(Osmanthus fragrans)品種的種子進行輻射處理發(fā)現(xiàn)，對桂花種子萌發(fā)狀況的影響存在顯著的品種間差異。60Co-γ輻射在亞麻育種中的應(yīng)用也有不少報道[22]。但都是針對纖維用亞麻或者是用射線照射花藥、愈傷組織等[23-26]。以不同品種胡麻種子為材料進行60Co-γ射線誘變育種的卻鮮有報道。胡麻種子含油量高，種皮較厚，對60Co-γ射線有較強的抗性，60Co-γ射線育種往往需要更高的劑量。

本研究以不同劑量60Co-γ射線對9個不同品種胡麻種子進行輻照處理，并進行種子萌發(fā)和幼苗生長試驗，旨在探索60Co-γ射線輻照對胡麻種子萌發(fā)和幼苗生長特性的影響，以期探尋胡麻種子半致死輻照劑量，為胡麻的輻照誘變育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試驗的胡麻品種天亞10號、定亞17號、張亞3號、隴亞9號、隴亞10號、隴亞11號、隴亞12號、隴亞13號、隴亞14號共9個品種，種子均于2016年收獲，由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所提供。種子含水量如表1所列。

表1 9個品種胡麻種子含水量Table 1 Water content of the seeds of nine varieties of oil flax

1.2 試驗方法

1.2.1 種子含水量測定

種子含水量采用烘干失重法測定。選取顆粒飽滿、大小均一的胡麻種子約10 g，80 ℃烘箱烘至恒重，用萬分之一電子天平測定種子烘干前后的干重，每個品種設(shè)置3個重復(fù)。按照以下公式計算種子含水量。

含水量 = (烘干前種子質(zhì)量 - 烘干后種子質(zhì)量)/烘干前種子質(zhì)量 × 100%。

1.2.2 種子輻照處理

選取顆粒飽滿、大小均一的胡麻種子送往山東省輻照中心，進行60Co-γ 射線輻照處理，輻照劑量率為 10 Gy·min-1，輻照劑量分別為 0(CK)、200、600、1 000、1 500、3 000、6 000、9 000、12 000、15 000 Gy 共 10 組。每個品種每個輻照劑量 1 000 粒種子，每個輻照劑量設(shè)置3個重復(fù)，共輻照3次。

1.2.3 室內(nèi)發(fā)芽試驗

將不同輻照處理后的種子用75%乙醇消毒20 min，無菌蒸餾水沖洗5～6次。將消毒后的種子均勻地擺放于已滅菌的種子萌發(fā)袋 (180 mm × 125 mm)內(nèi)，加入 30 mL 1/2 Hoagland 營養(yǎng)液。將種子萌發(fā)袋置于萌發(fā)架上垂直培養(yǎng)，萌發(fā)架置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)條件為25 ℃，光照12 h·d-1，光照強度為450 μmol·(m2·s)-1。每個萌發(fā)袋 40 粒種子，每個輻照劑量設(shè)置3個重復(fù)。共進行3次萌發(fā)試驗。

1.2.4 發(fā)芽和生長指標統(tǒng)計

從種子置床之日開始，每隔24 h觀察種子萌發(fā)情況并統(tǒng)計發(fā)芽種子數(shù)(以胚根突出種皮1 mm為標準)，連續(xù)統(tǒng)計7 d。在置床后8 d，統(tǒng)計出苗率，以2片子葉完全展開且根長大于1 cm視為出苗，用游標卡尺測定每個萌發(fā)袋所有出苗的幼苗株高和根長。并按下列公式統(tǒng)計發(fā)芽率、相對出苗率。

發(fā)芽率 = (正常萌發(fā)的種子數(shù)/供試種子數(shù)) ×100%；

相對出苗率 = 各輻照處理組出苗數(shù)量/對照組出苗數(shù)量 × 100%。

1.3 半致死劑量的計算及輻照敏感型的劃分

1.3.1 半致死劑量(LD50)的計算方法

種子的出苗率為對照50%時的輻照劑量為半致死劑量。利用以下公式計算胡麻種子的半致死劑量[21]。

式中：x為輻照劑量，y為不同劑量下相對出苗率 ×100，N是樣本量，LD50為所求半致死劑量。

1.3.2 相關(guān)關(guān)系的確定

相關(guān)系數(shù)反映了不同品種胡麻的相對出苗率與輻照劑量的相關(guān)關(guān)系。利用相關(guān)系數(shù)公式來計算相對出苗率與輻照劑量的相關(guān)系數(shù)(r)。

1.3.3 輻照敏感型的劃分

胡麻品種輻照敏感型的劃分方法，是以不同輻照劑量處理的各個品種相對出苗率所求出的半致死劑量為依據(jù)，并利用以下公式計算相對出苗率和半致死劑量[21]：

根據(jù)各品種半致死劑量的平均值(x)和標準差(s)，將半致死劑量的平均值加1個標準差以上的半致死劑量劃分為遲鈍型；以半致死劑量平均值減1個標準差以下的半致死劑量值劃分為敏感型；其余的為中間型。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。用單因素試驗統(tǒng)計分析方法，對胡麻不同處理的試驗數(shù)據(jù)進行差異顯著性檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻照處理對9個胡麻品種種子萌發(fā)狀況的影響

各個胡麻品種在種子萌發(fā)速度和發(fā)芽率方面存在差異(圖1)。置床后1 d張亞3號、隴亞10號和隴亞13號的發(fā)芽率超過50%，其他6個品種發(fā)芽率則低于50%，之后各品種的種子萌發(fā)率均隨著時間的延長不斷提高。隴亞14號發(fā)芽率最低，對照組種子萌發(fā)率僅有55.5%，其他8個品種發(fā)芽率均在90%以上，隴亞13號達100%。

經(jīng)過60Co-γ輻照，不同胡麻品種的種子萌發(fā)速度存在差異(圖1)。隴亞9號和隴亞14號2個品種在低于1 000 Gy輻照下，發(fā)芽率和發(fā)芽速度有所提高，之后隨著輻照劑量的提高，種子萌發(fā)能力下降，其中隴亞9號在 200 Gy輻照下發(fā)芽率達93.3%，隴亞14號經(jīng)過200 Gy輻照后發(fā)芽率達到70%，比對照提高了26%；其他7個品種的發(fā)芽率和發(fā)芽速度則隨著輻照劑量的提高而明顯下降。輻照劑量超過12 000 Gy時，胡麻種子雖有萌發(fā)，但由于生長點受損嚴重，代謝活動紊亂，生長停滯，置床8 d仍不能抽出胚根，種子最終喪失活力。

2.2 60Co-γ輻照處理對9個不同胡麻品種出苗率的影響

不同胡麻品種在60Co-γ輻照后出苗率和半致死劑量也有所不同(表2)。除了隴亞9號和隴亞14號外，其他7個品種的出苗率均隨輻照劑量增加而降低。適宜的輻照劑量可以不同程度地提高隴亞9號和隴亞14號出苗率，該劑量為200 Gy，隴亞9號在200和600 Gy輻照后相對出苗率高于未輻照組，分別達到103.75% 和101.28%。隴亞14 號在 1 000 Gy及以下輻照后出苗率高于對照組，200 Gy輻照后相對出苗率高達127.25%，顯著高于未輻照組(P＜0.05)。6 000 Gy輻照后，9個品種的相對出苗率均急劇下降，除了定亞17號和隴亞13號，其他品種均低于50%。

利用直線回歸方程 y = a + bx 和公式 (1)、(2)、(3) 計算出各胡麻品種半致死劑量范圍在 5 681～6 668 Gy，半致死劑量由高到低分別為隴亞14號(6 668 Gy)、 隴 亞 13 號 (6 521 Gy)、 定 亞 17 號(6 462 Gy)、天亞 10 號 (6 417 Gy)、隴亞 9 號 (6 399 Gy)、張亞 3 號 (5 869 Gy)、隴亞 11 號 (5 786 Gy)、隴亞 10 號 (5 716 Gy)、隴亞 12 號 (5 681 Gy)。

根據(jù)公式(4)計算各品種的相對出苗率與輻照劑量的相關(guān)系數(shù)，結(jié)果表明，9個品種的胡麻出苗率與輻照劑量呈負相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在-0.96～-0.89，即隨著輻照劑量的增加，其相對出苗率下降。

2.3 60Co-γ輻照處理對9個不同胡麻品種幼苗生長的影響

60Co-γ輻照對不同胡麻品種株高和根長的影響不同(圖2)。9個胡麻品種中除了張亞3號和隴亞13號的株高和根長隨輻照劑量升高而降低，其他7個品種在低劑量輻照處理后，株高和根長與對照相比均有所提高，之后隨輻照劑量增加，株高和根長逐漸減小。7個品種的株高和根長在200 Gy輻照劑量下達到最大，并隨著劑量的增加而降低，且7個品種能夠促進生長的輻照劑量區(qū)間有所不同：與未輻照組相比，隴亞12號在200 Gy處理后株高根長增加，大于600 Gy時減小；天亞10號、隴亞9號、隴亞10號、隴亞14號在200和600 Gy輻照后株高根長增加，劑量大于1 000 Gy時低于對照；而定亞17號和隴亞11號在1 000 Gy以下輻照時株高和根長高于對照，在劑量大于1 500 Gy時顯著減小。

60Co-γ輻照對胡麻根的影響大于對地上部分的影響。隨輻照劑量的增加，根長的降低趨勢大于株高的下降趨勢。1 500 Gy 輻照后側(cè)根變少；6 000 Gy輻照后胡麻幼苗根的生長受到明顯抑制，胚根膨大無毛，變粗變短；9 000 Gy輻照根系生長受到嚴重的影響，基本不能生長，或者出現(xiàn)根尖褐化，生長點明顯受到損傷。大于12 000 Gy時胡麻的子葉和胚根均不能抽出種皮。

圖1 不同劑量輻照處理對9個胡麻品種種子發(fā)芽速率和發(fā)芽率的影響Figure 1 Effect of different doses of radiation on the germination speed and rate of nine varieties of oil flax

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2.4 胡麻品種輻照敏感型的劃分

根據(jù)公式(5)計算出9個品種胡麻種子的半致死劑量的平均值為 6 169 Gy，標準差為 396 Gy，將半致死劑量大于6 565 Gy的材料劃分為遲鈍型，小于5 773 Gy劃分為敏感型，其余的為中間型。可以看出，9個品種中，隴亞10號和隴亞12號屬于輻照敏感型，天亞10號、定亞17號、張亞3號、隴亞9號、隴亞11號、隴亞13號屬于中間型，而隴亞14號則為輻照遲鈍型(表3)。

由此可見，不同品種胡麻種子的適宜輻照劑量存在差異，可能與胡麻品種種皮厚度、種子的大小、含水率、含油量有關(guān)。

表3 9個品種胡麻種子的輻照敏感性Table 3 Radiation sensitivity of the seeds of nine varieties of oil flax

3 討論

本研究結(jié)果表明，60Co-γ射線對胡麻種子具有一定的輻照效應(yīng)。低劑量輻照促進隴亞9號和隴亞14號萌發(fā)，原因是適當劑量的輻照處理會引起種子內(nèi)部生物自由基或有關(guān)酶活性的變化，從而提高了種子的新陳代謝水平，促進種胚組織細胞生長和分裂，提高種子活力[27]，或者低劑量的γ射線輻照可能會增加種子萌發(fā)過程中對氧氣的吸收量，導(dǎo)致有機或無機過氧自由基的產(chǎn)生，繼而打破種子休眠，同時在種子萌發(fā)的早期階段可以活化相關(guān)RNA或蛋白質(zhì)合成，從而提高種子萌發(fā)率[28]；而高劑量輻照使種胚組織受損，影響了細胞生長和分裂，延遲了種子萌發(fā)進程，使種子活力降低。類似結(jié)果在烏拉爾甘草[11]、鳶尾[19]、牧草[29]、野牛草(Buchloe dactyloides)[30]、高羊茅[31]、毛竹(Phyllostachys heterocycla)[32]、 萬 壽 菊(Tagetes erecta)[33]、貝殼花(Moluccella laevis)[34]中也有報道。

γ射線輻照可以導(dǎo)致植物在細胞水平上發(fā)生多種生化反應(yīng)，從而引起植株外觀形態(tài)發(fā)生變化[35]。本研究中，低劑量輻照可以促進7個品種幼苗株高和根長的生長，可能是由于低劑量的60Co-γ射線輻照可以提高植物體內(nèi)的生長素水平，進而刺激植物生長[36]。這與蘿卜(Raphanus sativus)[36]、香茅(Cymbopogon martinii)[37]等植物相似。本研究發(fā)現(xiàn)，在受到較大劑量輻照后胡麻幼苗根系受到的傷害大于幼芽，在高劑量輻照后胡麻不能成苗多是由根系損傷導(dǎo)致生長停滯造成。較高劑量的輻照會導(dǎo)致胚根肥大無毛，變粗變短，失去發(fā)芽能力，稱為“肥根”現(xiàn)象[38]。黃永芳等[39]認為這是由于過高劑量的輻照抑制了種胚分生細胞的有絲分裂，細胞分裂受阻，只發(fā)生分生細胞液泡化和伸長，胚突破種皮造成萌發(fā)假象。胡重怡等[40]在研究輻照對煙草 M1代種子萌發(fā)及幼苗生長時也發(fā)現(xiàn)60Co-γ射線對煙草(Nicotiana tabacum)幼根的損傷比幼芽大。朱宗文等[41]在研究60Co-γ射線對番茄幼苗生長的影響時也有同樣的發(fā)現(xiàn)。另外，在本研究中還發(fā)現(xiàn)一定劑量的輻照后，側(cè)根的生長首先受到明顯抑制，這與李志能等[42]在懸鈴木(Platanus hispanica)中的研究結(jié)果不同，說明不同植物對60Co-γ射線輻照的響應(yīng)也不盡相同。高劑量輻照后少數(shù)胡麻幼苗植株出現(xiàn)黃化、矮化、葉片畸形、變小、根尖膨大等誘變效應(yīng)，但是由于試驗時間短，尚不能確定引起此現(xiàn)象的原因是輻照后的生理損傷還是可遺傳的突變，因此還需要進一步觀察后代表型，并進行細胞學(xué)鑒定。

γ射線輻照對不同胡麻品種的影響不同。低劑量輻照提高隴亞9號和隴亞14號發(fā)芽率和出苗率，而降低了其他7個品種的發(fā)芽率和出苗率；適宜劑量的輻照可以促進天亞10號、定亞17號、隴亞9號、隴亞10號、隴亞11號、隴亞12號、隴亞14號幼苗株高和根長的生長，而抑制其他2個品種幼苗的生長。不同胡麻品種的輻照敏感程度也不同，本研究根據(jù)胡麻種子對60Co-γ 輻照敏感性的不同，將不同胡麻品種分為輻照敏感型、中間型和遲鈍型 3 種類型。已有學(xué)者研究了不同品種桂花[21]、 高 羊 茅[31]、 番 茄[39]、 小 麥[43]、 杜鵑(Rhododendron simsii)[44]的輻照效應(yīng)，認為種子輻照敏感性的差異與種子大小、種皮厚度、含水量和一些小分子物質(zhì)含量以及遺傳背景等各種外部和內(nèi)部因素有關(guān)。

輻射誘變的關(guān)鍵是確定適宜的輻照劑量，適宜的輻照劑量才能獲得有效的誘變。在一定范圍內(nèi)增加輻照劑量可以增加突變率、拓寬突變譜，但過高的輻照劑量會降低成活率[45]。一般都以半致死劑量作為輻照育種的適宜輻照劑量[21]。半致死劑量或稱臨界劑量，多作為衡量輻照效應(yīng)的一個指標，適宜的輻照劑量是輻照誘變中獲得有效輻照效應(yīng)的重要依據(jù)。半致死劑量既是確定輻照敏感性的主要指標，也是輻照育種適宜引變劑量的參考。有研究用輻照后的發(fā)芽率計算半致死劑量，結(jié)果往往偏大。因為經(jīng)過輻照處理后許多種子能正常發(fā)芽而最終不能成苗，主要原因是真葉不發(fā)育或根系無法形成，本研究中高劑量輻照后發(fā)芽率和成苗率也有很大差別，所以，用發(fā)芽率計算的輻照半致死劑量和大田試驗中得到的結(jié)果會有較大的差距。李秀芬等[12]和吳問勝等[46]也認為種子萌發(fā)率不宜作為輻照敏感性的指標。一般可采用生長量為對照的70%，或采用植株成苗率50%的劑量來確定其半致死劑量[47]。因此，本研究根據(jù)輻照后相對成苗率計算不同品種胡麻輻照的半致死劑量，范圍為 5 716～6 668 Gy。可見不同胡麻品種的半致死劑量差異較大，實際研究中要根據(jù)品種的抗輻照能力來確定輻照的適宜劑量。此外，本研究得到的胡麻半致死劑量較其他物種偏大，可能是由于胡麻作為油料作物，種皮較厚，種子較大，而且胡麻種子富含胡麻油、亞麻膠、果膠等，可能對輻照有一定的屏蔽作用，導(dǎo)致胡麻種子對輻照不敏感。這與同樣作為油料作物的油菜(Brassica napus)種子相似[48]。十字花科植物種子含有對輻照有屏障作用的丙烯芥子油，因此對輻射不夠敏感[49]。胡麻種子含油量較高，推測胡麻籽油對輻照也有一定的屏蔽作用。此外，種皮的厚度、結(jié)構(gòu)、膠質(zhì)和水分、酚類化合物及纖維素含量也會對輻照有一定的影響[49]，這也許是胡麻種子抗輻照能力較強的另一原因。

鄒德炎[50]提出，茶樹(Camellia sinensis)種子的適宜輻照劑量，應(yīng)當依據(jù)其萌動狀態(tài)、輻照后第1年的茶苗突變頻率和兩三年內(nèi)茶樹生長表現(xiàn)來確定。本研究僅對輻照后胡麻種子萌發(fā)和幼苗生長進行初步研究，是否能產(chǎn)生變異和能否定向選育尚無法得出結(jié)論。因此，研究輻照后胡麻整個生命周期的生長表現(xiàn)以及后代胡麻的表型是下一步的研究方向，輻照處理胡麻種子能否得到可遺傳的穩(wěn)定變異還需要進一步探索。

4 結(jié)論

根據(jù)對60Co-γ輻照敏感性的不同，胡麻種子可分為輻照敏感型，中間型和遲鈍型 3 種類型。除隴亞9號和隴亞14號外，其他7個品種種子發(fā)芽率與輻照劑量呈負相關(guān)關(guān)系。較低劑量的輻照可以提高隴亞9號和隴亞14號2個品種種子的發(fā)芽率和出苗率，增加天亞10號、定亞17號、隴亞9號、隴亞10號、隴亞11號、隴亞12號和隴亞14號 7個品種的根長和株高。而高劑量輻照降低了9個品種種子發(fā)芽率、出苗率及株高、根長。隴亞 14 號半致死劑量為 6 668 Gy，隴亞 13 號為 6 521 Gy， 定 亞 17 號 為 6 462 Gy， 天 亞 10 號 為 6 417 Gy，隴亞 9 號為 6 399 Gy，張亞 3 號為 5 869 Gy，隴亞 11 號為 5 786 Gy，隴亞 10 號為 5 716 Gy，隴亞12號為5 681 Gy。綜合萌發(fā)率、出苗率、幼苗生長等情況，建議輻照劑量應(yīng)控制在6 000 Gy左右。