副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素抑制人肺腺癌細(xì)胞活性的研究

，，2，3，，

生物毒素抗腫瘤來源于“以毒攻毒”這個(gè)說法，生物毒素固然有害，但也可以用于治病，許多科學(xué)家從不同的生物比如蛇、蜂、相思子、炭疽等里面提取毒素并用于腫瘤的治療，這已經(jīng)成為一種治療癌癥的新手段[1]。

耐熱直接溶血毒素(Thermostabile direct hemolysin，TDH) 來源于能夠引起人急性腸胃炎，傷口感染和敗血癥及海鯛、對蝦、九孔鮑、文蛤等水生動(dòng)物疾病的副溶血性弧菌(Vibrioparahaemolyticus,Vp),是一種分布較廣的細(xì)菌毒素[2]。TDH 蛋白是由兩條相同的多肽鏈構(gòu)成的、分子量為 42 kDa 的二聚體毒素蛋白[3]。其每條多肽鏈由165 個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，在近C 端有一個(gè)二硫鍵，呈神奈川陽性[4]。研究發(fā)現(xiàn)TDH 具有強(qiáng)烈的肝臟毒性、溶血活性、腸毒性、小鼠的致死性、心臟毒性[5-7]。

本文以試驗(yàn)室自己制備的高純度TDH毒素蛋白，通過比較TDH對不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性作用說明TDH對腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞。不同劑量、不同時(shí)間處理人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1細(xì)胞, 通過生長曲線和“創(chuàng)傷”試驗(yàn)評(píng)價(jià)TDH在體外對腫瘤細(xì)胞生長、增殖及遷移的影響，進(jìn)一步用流式細(xì)胞法和熒光試劑盒檢測TDH對SPC-A-1細(xì)胞凋亡和caspase-3活化的影響，以探討其體外抑制肺腺癌細(xì)胞的機(jī)理，以期為海洋來源的生物毒素—TDH抗腫瘤的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供科學(xué)的資料和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 致病性副溶血弧菌ATCC33846 (標(biāo)準(zhǔn)菌株)購于北京中原公司；DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析柱購自上海思吉生物制品有限公司；Annexin V細(xì)胞凋亡試劑盒購自BD pharmingentm公司；Caspase-3熒光檢測試劑盒購自KeyGEN BioTECH公司；人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1、人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、人肝成纖維細(xì)胞LO2由華東理工大學(xué)藥學(xué)院劉建文教授惠贈(zèng)； BSA (牛血清蛋白)購于上海正極生物有限公司；DMEM培養(yǎng)基、RPMI1640、胎牛血清均購于上海普飛生物有限公司。快速吉姆薩染液購于生物工程股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1TDH的制備及純化 37 ℃條件下對致病性副溶血弧菌ATCC33846進(jìn)行搖床擴(kuò)大培養(yǎng)16 h，8 000 r/min離心取上清去掉菌體，硫酸銨鹽析提取粗蛋白，然后依次經(jīng)過DEAE-纖維素、DEAE-Sephadex A-50、葡聚糖G-75層析純化TDH[8]，將純化后的TDH 100 ℃，水浴加熱10 min，與用PBS緩沖液制備的小鼠的紅細(xì)胞懸液進(jìn)行反應(yīng)，通過紅細(xì)胞的裂解情況檢測純化后TDH的溶血活性， 用非變性凝膠電泳檢測純度，冷凍干燥。

1.2.2TDH的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞，人結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、人肝成纖維細(xì)胞LO2，用含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以5 000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，每孔體積為100 μL，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，等細(xì)胞貼壁后。用不同濃度的TDH(0、1.5625、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL)分別處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中孵育24 h。24 h后每孔加入10 μLMTT(濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，使沉淀充分溶解，最后以570 nm為檢測波長，655 nm為參考波長用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值。用改良寇氏法計(jì)算出每株細(xì)胞的半抑制劑濃度IC50。

改良寇氏法：LogIC50=Xm-I*(P-(3-Pm-Pn)/4)

Xm：Log最大藥物劑量，I：Log(最大藥物劑量/相鄰劑量)，P：陽性反應(yīng)率之和，Pm：最大陽性反應(yīng)率，Pn：最小陽性反應(yīng)率

1.2.3生長曲線 取對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞，用含5%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，以3000細(xì)胞/孔的密度接種于96孔板，每孔體積為100 μL，于37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，等細(xì)胞貼壁后。用不同濃度的TDH(0、0.5、1、2、3、4 μg/mL)分別處理，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，在培養(yǎng)箱中連續(xù)孵育9 d。不同時(shí)間在相應(yīng)的孔中加入10 μL MTT(濃度為5 mg/mL)，繼續(xù)孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去上清液，每孔加100 μL DMSO，置搖床上振蕩10 min，使沉淀充分溶解，最后以570 nm為檢測波長，655 nm為參考波長用酶標(biāo)儀測定各孔光吸收值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.4“創(chuàng)傷”試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞，制備單細(xì)胞懸液，以1×105細(xì)胞/mL接種于24孔培養(yǎng)板，每孔1 mL。置37 ℃，5% CO2的培養(yǎng)箱中孵育，到細(xì)胞長成單層后，用200 μL的塑料槍頭造一道劃痕，用PBS清洗1遍，顯微鏡拍照，并用目鏡測微尺(用鏡臺(tái)測微尺校正)測量劃痕寬度后，每孔加入一定濃度的藥物(4、2、1、0.5 μg/mL)處理，每濃度平行3孔，對照組加等量體積的培養(yǎng)液，孵育48 h，用目鏡測微尺測量劃痕寬度[9]。

細(xì)胞遷移的距離=藥物處理前的劃痕寬度-藥物處理后的劃痕寬度/2

1.2.5細(xì)胞凋亡試驗(yàn) 用 BD pharmingentm提供的試劑盒測定Annexin V染色測定細(xì)胞凋亡。取對數(shù)生長期SPC-A-11×105細(xì)胞/mL接種于細(xì)胞培養(yǎng)板后，孵育過夜，然后將5-FU或TDH加入培養(yǎng)孔中。處理24 h后，用胰酶消化，離心后加入培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液。在100 μL細(xì)胞懸液中加入Annexin V試劑100 μL，孵育20 min后在室溫下進(jìn)行分析，通過Accuri C6流式細(xì)胞儀檢測不同處理組SPC-A-1細(xì)胞的凋亡情況，采用數(shù)據(jù)分析軟件csampler BD進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

1.2.6caspase-3活性試驗(yàn) 取對數(shù)生長期的SPC-A-1細(xì)胞，以1×105細(xì)胞/mL接種于6孔板，置37 ℃，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵育12 h，每孔加入1 mL的5 μg/mL的TDH處理不同時(shí)間，設(shè)陰性對照，收集細(xì)胞。加入100 μL冰冷的細(xì)胞裂解緩沖液(使用前每50 μL 細(xì)胞裂解緩沖液加入0.5 μL DTT)，吹打均勻；置冰上裂解20 min，其間渦旋振蕩3次，每次10 s。4 ℃，10 000 r/min離心1 min后，小心吸取上清轉(zhuǎn)移至新的管中，并放置冰上待用；取少量上清(1～2 μL)，Braford法測定蛋白濃度。按照說明書吸取30 μL含100～200 μg蛋白的細(xì)胞裂解上清，依次加入反應(yīng)緩沖液，ddH2O以及加入Caspase-3底物反應(yīng)液，并于37 ℃避光孵育1.5 h；用熒光酶標(biāo)儀測定熒光強(qiáng)度(激發(fā)波長=485 nm，發(fā)射波長=535 nm)。通過計(jì)算TDH處理組比陰性對照組平均熒光強(qiáng)度的倍數(shù)來確定TDH處理組Caspase-3活化程度。以10 mmol/L PBS和反應(yīng)緩沖液 作為空白對照。

2 結(jié) 果

2.1TDH的純化 經(jīng)過一系列層析后得到的TDH樣品進(jìn)行進(jìn)行溶血活性檢測，用PBS緩沖液和沒有進(jìn)行加熱處理的TDH作為對照，經(jīng)過加熱處理后有活性的樣品孔內(nèi)沒有紅細(xì)胞沉淀，將這部分洗脫液進(jìn)行合并濃縮得到最后的樣品，結(jié)果見圖1，非變性凝膠電泳顯示單一條帶，見圖2。說明本試驗(yàn)中得到的TDH是具有活性并且純度較高的，該樣品冷凍干燥。使用前，溶解于少量pH7.4 , 0.01 mol/L的PBS或者培養(yǎng)基中。

a：PBS對照組；b：TDH對照組；c、d、e：TDH加熱組圖1 TDH洗脫液的溶血活性測定Fig.1 Determination of hemolytic activity of TDH eluent

1. 分子量marker; 2. TDH圖2 純化后的TDH非變性SDS-PAGE電泳圖Fig.2 Non denatured SDS-PAGE electrophoresis of purified TDH

2.2TDH的細(xì)胞毒性試驗(yàn) 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細(xì)胞、NCM460細(xì)胞、LO2細(xì)胞，對其半抑制劑濃度IC50的影響見表1。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出：正常細(xì)胞的IC50高出肺腺癌細(xì)胞近20倍，由此可見TDH對腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞具有選擇性。

2.3TDH對 SPC-A-1細(xì)胞生長曲線的影響 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細(xì)胞，對其生長曲線的影響見圖3。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出：TDH劑量依賴性抑制SPC-A-1細(xì)胞的生長, 與對照組相比，TDH明顯減緩了SPC-A-1細(xì)胞生長對數(shù)期，使斜率壓低，縮短了平臺(tái)期，加速了衰亡期。

表1 TDH對不同細(xì)胞的半數(shù)抑制量
Tab.1 Half maximal inhibitory concentration of different cells treated by TDH

細(xì)胞IC50(μg/mL)SPCA16.7NCM460151LO2118

圖3 TDH對SPC-A-1細(xì)胞生長的抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of TDH on the growth of SPC-A-1 cell

2.4TDH對 SPC-A-1細(xì)胞遷移能力的影響 不同濃度TDH處理 SPC-A-1細(xì)胞，對其遷移能力的影響見圖4。試驗(yàn)結(jié)果可以看出：隨著TDH濃度的增大，SPC-A-1細(xì)胞移動(dòng)的距離越來越小，呈劑量依賴性。說明TDH可以抑制SPC-A-1細(xì)胞的遷移。

與對照組比較 *P<0.05， **P<0.01圖4 TDH對SPC-A-1細(xì)胞移動(dòng)能力的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of TDH on the migration of SPC-A-1 cell

2.5TDH對 SPC-A-1細(xì)胞凋亡的影響 Phosphatidyl serine(PS)通常是定位在質(zhì)膜的脂質(zhì)雙層膜的內(nèi)表面。當(dāng)細(xì)胞凋亡時(shí)，PS是外翻的、可由Annexin V-FITC檢測。因此，膜聯(lián)蛋白可作為程序性細(xì)胞死亡的標(biāo)志物。TDH處理24 h后誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞凋亡顯著增加(早期)(圖5)。正常對照組，陽性對照組5-Fu (20 μg/mL)，5 μg/mL TDH處理組SPC-A-1細(xì)胞的凋亡率分別為2.40%、53.20%和33.30%，在5-FU和TDH處理組分別表現(xiàn)出51.9%和33%的早期凋亡事件。因此，我們認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是TDH引起SPC-A-1細(xì)胞死亡的重要作用機(jī)制。

a：陰性對照； b：陽性對照組；c：TDH 處理組圖5 TDH誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞凋亡的作用Fig.5 Effect of TDH on inducing apoptosis of SPC-A-1 cell

2.6TDH對caspase-3活性的影響 5 μg /mL的 TDH處理SPC-A-1細(xì)胞后，分別在1, 1.5, 2, 2.5h檢測 caspase-3的活性，發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的延長，caspase-3的活性逐漸增加(圖6)。

與對照組比較，*P<0.05,**P<0.01圖6 5 μg /mL TDH對SPC-A-1細(xì)胞caspase-3的激活Fig.6 Activation of Caspase-3 in SPC-A-1 cell by TDH (5 μg /mL)

3 討 論

細(xì)菌毒素是天然毒素的一種，指微生物產(chǎn)生的具有自身防衛(wèi)作用的各種物質(zhì)。近年研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌毒素不僅具有毒理作用，也具有藥理作用，可作為天然來源的抗腫瘤藥物,是新型藥物開發(fā)的重要研究靶標(biāo)，是近年來興起的用于癌癥治療的新思路[10]。許多細(xì)菌毒素都是與配體融合然后結(jié)合到腫瘤細(xì)胞上發(fā)揮作用,因此免疫毒素一般設(shè)計(jì)成配體或抗體與細(xì)菌毒素融合的嵌合蛋白,從而定位到特異的靶標(biāo)細(xì)胞上發(fā)揮作用,如YangX等將白喉毒素的催化兼移位區(qū)域(提供靶向和毒性作用)和人表皮生長因子融合成新蛋白在體內(nèi)和體外均有良好的抗腫瘤活性，并且在小鼠體內(nèi)沒有顯示出任何非特異性全身毒性[11]。一個(gè)包含白細(xì)胞介素2和白喉毒素片段的融合毒素被批準(zhǔn)用于T淋巴細(xì)胞瘤的治療[12]。以上研究提示，細(xì)菌毒素對多種腫瘤有較好療效,且能克服傳統(tǒng)癌癥療法的缺陷,在癌癥治療中具有重要價(jià)值和應(yīng)用前景。

近年來的研究表明：副溶血弧菌耐熱直接溶血毒素(TDH)可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞系的增殖，顯示出一定的抗腫瘤活性[13]。本試驗(yàn)測得在TDH處理人的結(jié)腸上皮細(xì)胞NCM460、人肝成纖維細(xì)胞LO2 、人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1 24h之后，細(xì)胞的半抑制劑濃度IC50分別為151μg/mL、 118μg/mL和6.7μg/mL。通過TDH對不同細(xì)胞的細(xì)胞毒性比較，兩株人的正常細(xì)胞的IC50比SPC-A-1高出近20倍，由此可知，TDH對腫瘤細(xì)胞的毒性遠(yuǎn)大于正常細(xì)胞，對腫瘤細(xì)胞具有選擇性。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):經(jīng)純化后的TDH處理人肺腺癌細(xì)胞SPC-A-1 24h，結(jié)果顯示：TDH劑量依賴性抑制SPC-A-1細(xì)胞的生長，能減緩細(xì)胞生長的對數(shù)期、縮短平臺(tái)期，促進(jìn)衰亡期。圖2和圖3可以看出：TDH能明顯抑制SPC-A-1細(xì)胞的克隆形成及遷移能力。據(jù)報(bào)道，癌細(xì)胞的克隆形成能力與癌細(xì)胞的增殖能力和轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)[14]，而癌細(xì)胞的遷移能力在癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移過程中起關(guān)鍵作用。進(jìn)一步，流式細(xì)胞儀研究采用膜聯(lián)蛋白V染色法，它反映了細(xì)胞可能死亡的兩種截然不同的方式：凋亡和壞死途徑。大部分潛在的抗腫瘤藥物會(huì)通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而殺傷細(xì)胞[15]。5μg/mLTDH顯示出33%細(xì)胞凋亡，明顯高于正常對照細(xì)胞凋亡率，說明細(xì)胞死亡是通過細(xì)胞凋亡途徑介導(dǎo)。進(jìn)一步的研究表明：TDH能誘發(fā)caspase-3的活化，說明TDH可能通過激活caspase-3誘導(dǎo)了細(xì)胞的凋亡。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，caspase-3依賴性的細(xì)胞凋亡通過兩條途徑引發(fā)：細(xì)胞表面的死亡受體起始的外源性途徑或者線粒體起始的內(nèi)源性途徑[16-17]。進(jìn)一步的試驗(yàn)需要探明TDH是通過其中哪一條途徑誘導(dǎo)凋亡的機(jī)理。

總之，本研究說明TDH可以有效地抑制SPC-A-1細(xì)胞的生長、增殖及體外轉(zhuǎn)移能力可能與TDH激活caspase-3而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)，提示TDH可能是一種潛在的治療人肺癌的生物治療方法。TDH在體內(nèi)對腫瘤細(xì)胞的抑制及其作用機(jī)制的研究將在后續(xù)試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。

利益沖突：無