高效液相色譜法測定淡水漁業用水中諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星殘留

孟麗華，史艷偉，時彥民，簡康，劉方，鄧晨曦

（濟寧市漁業監測站，山東 濟寧 272000）

諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素藥物具有廣譜、高效的特點,被廣泛應用到水產養殖業中，起到了良好的效果[1-2]。但是調查發現在漁業養殖中使用的抗生素僅有小部分被魚類吸收利用，還有大部分沒有被食用或被食用后因沒有被吸收以排泄物的方式排到水體中，在養殖水體中的大量殘留，污染養殖環境的同時，對養殖漁業的健康發展也產生了不良影響[3-5]。因此，喹諾酮類抗生素藥物的使用和監測應得到廣泛的關注和高度的重視。但是，到目前為止對喹諾酮類藥物殘留的檢測主要集中在水產品和海水養殖環境中，檢測方法主要有液-質聯用法[6-7]、高效液相色譜法[8-9]、酶聯免疫法和熒光光度法等[10-11]，國內外針對淡水漁業用水中的檢測方法比較少見，對淡水漁業用水中的喹諾酮類抗生素藥物的含量沒有相關的限制值[12]，也沒有相關的國標、行標、地標，存在一定的監管盲區。

該次試驗在參考相關文獻的基礎上，選取合適的富集和凈化方法，對前處理條件和色譜條件進行優化，建立了用高效液相色譜-熒光法測定淡水漁業用水中的諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星3種喹諾酮類抗生素藥物，并用該方法對濟寧地區的太白湖濕地、兗州興隆莊和鄒城西故煤炭塌陷地的漁業用水進行了檢測。

1 材料與方法

1.1 淡水漁業用水采集

淡水漁業用水主要采集自濟寧太白湖濕地、兗州興隆莊煤炭塌陷地和鄒城西故煤炭塌陷地等的養殖區，用采水器分別采集每個養殖水體的表層水500 mL，放在4℃冰箱內密封保存。

1.2 儀器設備與試劑

1.2.1 儀器設備 Agilent 1200型高效液相色譜儀，配熒光檢測器；固相萃取裝置（美國Agilent）；talboys漩渦混合器（上海安普試驗技術股份有限公司）；KQ3200DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli～Q超純水器（上海默克化工技術有限公司）；氮氣吹干裝置（美國Agilent）；MP511型試驗室PH計（上海三信儀表廠）；Oasis HLB固相萃取小柱（3 mL/60 mg，Waters公司）。

1.2.2 標準品和試劑 諾氟沙星（純度≥99.0%）、環丙沙星（純度≥99.4%）、恩諾沙星（純度≥99.7%）均購自TMtandard。甲醇、乙腈為色譜純；三乙胺、磷酸為分析純；試驗過程中所用水均來自Milli～Q超純水器。分別稱取諾氟沙星標準品、環丙沙星標準品和恩諾沙星標準品各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至100 mL的棕色容量瓶中，配置成濃度為100μg/mL的標準儲備液，保存在-18℃冰箱中，保質期不超過6個月。

1.3 試驗方法及步驟

1.3.1 樣品前處理 量取經過0.45μm玻璃纖維濾膜過濾的水樣50 mL，用稀鹽酸調節pH值至4.0，然后用HLB柱進行富集、凈化。將HLB分別依次用3 mL的甲醇和3 mL的純水進行活化后，水樣過柱（控制流速1 mL/min以內），先用3 mL的蒸餾水水淋洗，減壓抽干后，用8 mL甲醇進行洗脫（控制流速1 mL/min），洗脫液在35～40℃下氮氣吹干。吹干后用1.0mL的流動相進行定容,渦旋使得殘渣充分溶解，過0.22μm水相濾膜，待測。

1.3.2 色譜方法 色譜柱：Water X BridgeC18柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：A為500 mL水加入3 mL磷酸混和均勻后用三乙胺調節pH值至2.4，B 為乙腈（A：B=82：18）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40℃；進樣量20μL；檢測器：熒光檢測器；激發波長為280 nm；發射波長為450 nm。

1.3.3 標準曲線的制備 準確量取一定量的標準儲備液，用流動相將諾氟沙星、恩諾沙星稀釋成濃度分別為2.5、5.0、10.0、25.0、50.0、100.0、250.0 μg/L的標準工作液、將環丙沙星稀釋成濃度為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的標準工作液待用。按濃度由低到高依次進樣，每一個濃度重復進樣2次取平均值，以峰面積的平均值為縱坐標，標準溶液的濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程和相關系數。

1.3.4 檢出限和定量限的計算 在不含3種喹諾酮類抗生素待測組分的空白漁業用水中加入諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星標準儲備液，處理分析后，以濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算3倍信噪比時對應的濃度為分析物的最低檢測濃度，即方法的檢出限；10倍信噪比時對應濃度為分析物的最低定量濃度，即定量限。

1.3.5 回收率和精密度的計算 選用不含3種喹諾酮類抗生素待測組分的漁業用水空白樣品，制成3組不同濃度的標準添加樣品，其中，諾氟沙星、恩諾沙星在5.0、25.0、50.0μg/L 3個濃度水平進行加標回收試驗，環丙沙星在1.0、5.0、10.0μg/L 3個濃度水平進行加標回收試驗，每個添加濃度進行6個平行試驗，按照“1.3.1”和“1.3.2”的方法步驟進行處理和分析，計算回收率和相對標準偏差。

2 結果與討論

2.1 前處理條件的優化

在參考相關文獻的基礎上，該文對固相萃取柱、上樣pH值及體積、洗脫試劑及其體積等對試驗結果有影響的因素進行進行了分析討論，確定了前處理的最優條件。

2.1.1 固相萃取柱的選擇 該文分別采用藥殘凈化和富集最常用的固相萃取柱C18小柱和HLB小柱進行了試驗，以凈化效果和回收率作為評價依據。在其他條件不變的前提下，用不同的萃取柱進行試驗，結果表明，采用HLB小柱萃取的樣品回收率略高于C18小柱，且圖譜干凈，雜峰較少，因此，該方法采用HLB小柱對樣品凈化。

2.1.2 上樣pH值 由于固相萃取的效率會受到樣品pH值的影響，因此該文對上樣pH進行了優化。一般淡水的pH值在6.5～8.5，以空白的淡水漁業用水為基質，調節pH值，使得pH值分為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 然后分別加入目標喹諾酮類抗生素混合標準溶液，混合均勻后采用“1.3.1”的提取方法和步驟進行處理，在不考慮其他因素的干擾的情況下以加標回收率為評價依據最終發現當pH為4.0時3種喹諾酮類抗生素的回收率較高，并且重現性較好。

2.1.3 上樣體積 以過濾后的淡水漁業用水為基底，加入3種喹諾酮類抗生素混合標準溶液，分別考察 10、20、30、40、50、60、70、80 mL 上樣體積對回收率的影響。3種喹諾酮類抗生素都在上樣體積為50 mL時回收率達到最大值，之后有趨于平穩，因此最終上樣體積選擇50 mL。

2.1.4 洗脫試劑及其體積 為了降低基質效應，試驗對乙腈和甲醇的洗脫效果進行了比較。當用乙腈做洗脫劑時，加標樣品中的諾氟沙星回收率為48.2%、環丙沙星回收率為53.7%、恩諾沙星的回收率為52.5%；當用甲醇做洗脫劑時加標樣品中的諾氟沙星的回收率為75.5%、環丙沙星的回收率為78.2%、恩諾沙星的回收率為73.5%。由此看見用甲醇做洗脫劑時回收率較高，所以該試驗選擇的洗脫劑為甲醇，根據結果比較，甲醇洗脫體積定為8 mL。

2.2 色譜條件的優化

因為喹諾酮類化合物同時具有酸性基團和堿性基團，易形成拖尾，從而使得諾氟沙星和環丙沙星很難在短時間內完全分離，而加入三乙胺作為改良劑能夠改善拖尾現象。在用三乙胺調節流動相的pH值時，發現pH值在2.4時3種目標物可以在合適的時間分離完全。同時，流動相中的乙腈含量對保留時間影響很大，經過對乙腈和磷酸鹽不同比列的試驗，發現當乙腈：磷酸鹽=18：82時諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星的出峰時間在6～10 min，而樣品中的雜峰會集中出現在6 min之前，不會對目標物造成干擾。

2.3 標準曲線和檢出限

按1.3.3方法和步驟繪制標準曲線，按1.3.4方法和步驟計算檢出限，線性方程、相關系數、檢出限和定量限列于表1。

表1 3種喹諾酮類藥物線性范圍和檢出限

2.4 回收率與精密度

按1.3.5方法和步驟計算回收率和精密度，結果見表2，其中諾氟沙星的回收率為85.9%～92.6%，相對標準偏差為3.77%～6.73%；環丙沙星的回收率為78.0%～84.4%，相對標準偏差為3.82%～6.26%；恩諾沙星的回收率為81.0%～89.9%，相對標準偏差為3.65%～7.73%。

表2 加標回收率和相對標準偏差

2.5 液相色譜圖

空白淡水漁業用水、淡水漁業用水加標樣品（諾氟沙星、恩諾沙星12.5μg/L，環丙沙星2.5μg/L）、標準樣品（諾氟沙星、恩諾沙星12.5μg/L，環丙沙星2.5μg/L）的色譜圖分別見圖1中的a、b、c。由圖可見，在1.3.2色譜條件下，3種抗生素分離效果很好。

2.6 實際樣品的測定

從濟寧太白湖濕地、兗州興隆塔煤炭塌陷地、鄒城西固煤炭塌陷地等3個地區的9個養殖場采集漁業用水9份，按1.3.1前處理步驟和1.3.2的檢測方法對采集的水樣進行處理和檢測分析，9個養殖場的漁業用水中3種喹諾酮類藥物均低于檢出限。

3 結論

該研究的結果表明高效液相色譜-熒光法適用于淡水漁業用水中喹諾酮類抗生素含量的檢測，此方法專屬性強、靈敏度高，凈化和分離效果好，相對于液-質聯用儀的檢測方法具有操作簡單，成本低的優點。此法可應用于淡水養殖地區不同漁業用水中的喹諾酮類抗生素含量的測定，為養殖用水中喹諾酮類抗生素藥物的生態風險評估提供科學的依據。

圖1 喹諾酮類抗生素的液相色譜圖