泌乳素及其受體在尖銳濕疣的表達

江中洪 江玉娥 曾茂森

尖銳濕疣(condyloma acuminatum,CA)是人乳頭瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染外生殖器、肛周等部位引起的一種常見的、易復發(fā)的性傳播疾病。許多研究表明，CA的發(fā)生、消退、復發(fā)及癌變與機體的免疫功能密切相關。泌乳素(prolactin, PRL)是垂體前葉分泌的多肽激素，皮膚是垂體外PRL的重要合成及靶向器官，參與調(diào)節(jié)細胞增殖與分化、免疫應答等生理過程。本研究采用化學發(fā)光法和免疫組化檢測CA患者外周血PRL以及皮損泌乳素受體(prolactin receptor, PRLR)的表達情況，并探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 研究對象 2017年6月至2018年6月在我院皮膚性病科和婦產(chǎn)科就診的尖銳濕疣患者共40例，均符合《中國臨床皮膚病學》中尖銳濕疣的診斷標準[1]。男、女各20例，年齡18～38歲，平均(24.3±4.2)歲，患者1年內(nèi)均未接受免疫抑制劑治療，排除口服大量雌激素、避孕藥、妊娠及哺乳期婦女，且無嚴重心肝腎疾病、腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及其他感染性疾病。對照組包皮組織和外周血PRL取自健康男性20名，平均(20.4±7.2)歲，由皮膚外科和泌尿外科提供，另再抽取非孕期健康女性20名外周血PRL作為對照組。所有皮膚和皮損標本經(jīng)10%甲醛固定，石蠟包埋并連續(xù)切片。兩組在年齡構成(t=0.49,P=0.72)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準，患者簽署知情同意書。

1.2 主要儀器和試劑 Access2化學發(fā)光免疫分析儀購自美國Beckman coulter公司，PRL試劑購自羅氏公司，BX51-P雙目電子顯微鏡購自日本Olympus株式會社，兔抗人PRLR抗體購自武漢博士德公司。

1.3 方法

1.3.1 PRL檢測 所有入選對象均用干燥管收集外周血3ml，及時分離血清檢測，由檢驗科按操作常規(guī)進行上機檢測。

1.3.2 免疫組化SP法 采用免疫組織化學鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP法)進行檢測，接試劑盒說明書進行。手術取尖銳濕疣皮損和對照組包皮組織，4%甲醛液固定，石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。切片脫蠟至水，3%過氧化氫溶液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，抗原120℃修復3 min，正常山羊血清封閉10 min，加入一抗37℃孵育1 h，生物素標記的二抗和鏈霉親和素-過氧化物酶(SP)復合物各在37℃溫箱孵育30 min。DAB顯色，蘇木精復染，脫水，透明，封片。用已知陽性片作陽性對照。用PBS代替一抗作空白對照。

1.3.3 結果判定[2]免疫組化染色以胞質(zhì)或胞膜棕黃色著色為陽性細胞，根據(jù)陽性細胞著色強度和百分比確定PRLR表達的半定量分級：①按細胞著色強度,無色為0分，淺黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分；②按陽性細胞百分比，≤10%為0分，11%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，≥76%為4分。據(jù)上述兩項分值的乘積，0為陰性(-)，1～4分為弱陽性(+)，6～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。采取單盲法，每張切片隨機選取5個高倍(×400)視野，取其得分的平均數(shù)判斷該標本的半定量等級，表達陽性率：表達陽性率=陽性標本數(shù)/總標本數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，計數(shù)資料的比較采用χ2檢驗，計量資料用均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗，以P<0.05為有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 外周血PRL在尖銳濕疣患者和對照組的表達比較 本院PRL參考值男性為(4.04～15.20)ng/mL，非孕期女性為(4.79～23.30)ng/mL，本次實驗男性CA患者PRL為(9.24±4.68)ng/mL，健康男性對照組為(8.42±3.83)ng/mL，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=0.606,P=0.548)，女性CA患者為(14.62±6.23)ng/mL，健康女性對照組為(12.42±5.46)ng/mL，兩組比較差異無統(tǒng)計學意義(t=1.188,P=0.242)，見表1。

表1 各組PRL表達水平比較(ng/mL)

2.2 PRLR在尖銳濕疣皮損和正常包皮組織中的表達比較 見表2。

表2 PRLR在CA組和包皮組皮損表達情況(例)

PRLR在尖銳濕疣皮損有不同程度的陽性表達，PRLR受體陽性細胞集中分布于基底層、棘層細胞下部，中到強陽性表達，在角質(zhì)層細胞較少表達。疣體血管內(nèi)皮細胞也可見到中到強陽性表達(圖1)。在20名健康者的包皮組織PRLR受體呈弱陽性表達或不表達，分布于基底層細胞和棘層細胞 (圖2)。CA患者PRLR受體陽性表達水平均顯著高于對照組(χ2=33.35，P=0.00)。

圖1 a,b,c在基底層及基層下部細胞、血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)及胞膜被染成棕黃色(SP，×200)

圖2 a,b,c在基底層及基層下部細胞、血管內(nèi)皮細胞的胞質(zhì)及胞膜被染成淺棕黃色(SP，×200)

3 討論

PRL由199個氨基酸組成的23kDa單鏈蛋白，由于翻譯后加工、修飾的不同，23 kDa的 PRL經(jīng)蛋白水解切割后可生成14kDa、17kDa及22 kDa的變異型，在血清中PRL多以單體形式存在，也可形成二聚體、三聚體。PRL主要的功能是在妊娠期和哺乳期促進乳腺發(fā)育，乳汁合成和乳汁分泌的維持[3]。PRLR是造血細胞因子受體超家族成員，包括細胞外結構域，單個跨膜結構域和細胞內(nèi)信號轉導結構域，幾乎存在于所有的組織和器官。由于選擇轉錄和翻譯不同，PRLR主要包括2個亞型:長型分子量為87 kDa，對PRL 親和力較高；短型分子量為36 kDa，對PRL親和力較低。這些同種型具有相同的細胞外結構域，但細胞內(nèi)部分的大小和序列可能不同；此外，還有一種可溶性PRLR(PRL結合蛋白)，只含有膜受體的細胞外結構域。在人體中發(fā)現(xiàn)的PRLR的主要同種型是長型，人PRLR除與PRL結合， PRLR還可以結合胎盤催乳素和生長激素[4]。

PRL與膜受體PRLR結合形成三聚體，通過激活JAK2/STAT5、c-Src、PI3K/AKT、MAPK、Nek3-vav2-Racl等信號通路發(fā)揮生物學作用。PRL及PRLR表達于角質(zhì)形成細胞、皮膚附屬器、血管內(nèi)皮細胞、成纖維細胞及免疫細胞中，參與調(diào)節(jié)細胞增殖與分化、毛囊周期、免疫應答等生理過程[5]。與垂體不同的是皮膚細胞中PRL及其受體表達主要受P物質(zhì)、IFN-γ及TNF-α等細胞因子的調(diào)節(jié)[1，3]。

在表皮中PRL及PRLR主要表達于基底細胞層，PRL可促進表皮KC增殖，在體外培養(yǎng)皮膚KC中，PRLR表達與KC分化程度有關[6]。在皮膚免疫系統(tǒng)中，真皮T細胞、B細胞、巨噬細胞等均可表達PRLR，PRL可促進T細胞、B細胞增殖，抑制糖皮質(zhì)激素誘導的淋巴細胞凋亡[7]。PRL可促進B細胞的抗原反應性、免疫球蛋白和自身抗體產(chǎn)生，增加Th-1細胞分泌IFN-γ、IL-2，PRL可促進巨噬細胞分泌IL-2發(fā)揮抗腫瘤作用[8]。PRL還可通過增加IFN-α分泌，影響朗格漢斯細胞的遷移、抗原提呈功能，在免疫反應中扮演著重要的角色[9]。

血管內(nèi)皮細胞中低表達PRL，PRL可以通過上皮細胞、白細胞、巨噬細胞刺激血管生成因子如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達。PRL及其變異型在血管內(nèi)皮細胞增殖和血管形成中起重要作用，23 kDa PRL可刺激血管形成，而16 kDa PRL通過與血管內(nèi)皮細胞結合，抑制其增殖和促進凋亡，被稱為血管抑制素，還可抑制血管內(nèi)皮細胞遷移，收縮血管降低血管通透性，而且對腫瘤的發(fā)生有抑制作用[10]。

有研究者對頑固性復發(fā)的合并有高泌乳素(HPL)血癥的女性CA患者，通過口服溴隱亭降低血泌乳素水平后，CA的復發(fā)明顯減少[11]。本實驗結果顯示，PRLR受體陽性細胞集中分布于基底層、棘層細胞下部，中到強陽性表達，在角質(zhì)層細胞較少表達，提示PRL可刺激基底層細胞的增殖；同時，疣體血管內(nèi)皮也可見PRLR的中到強陽性表達，提示PRL在血管的增殖和形成中起重要作用。但在患者外周血中檢測PRL，較健康對照組稍高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，部分復發(fā)性CA患者PRL升高較為明顯，與頑固性復發(fā)的合并有高泌乳素血癥的女性CA患者不同的是，本研究中僅僅是部分復發(fā)性CA患者PRL升高較為明顯，推測患者皮損PRLR表達的增強，可能與HPV促進角質(zhì)形成細胞的異常分化有關，或者是PRLR表型的表達出現(xiàn)變異有關，與PRL的結合力發(fā)生增強，其中的機制值得進一步探討。