三例散發(fā)I型神經(jīng)纖維瘤病患者NF1基因突變檢測(cè)

郎小喬 孫勇虎 付希安 孫樂(lè)樂(lè) 劉 紅 張福仁

I型神經(jīng)纖維瘤病(neurofibromatosis type 1，NF1， OMIM：162200)又稱(chēng)Von Recklinghausen病，是一種常見(jiàn)的常染色體顯性遺傳病，其特征表現(xiàn)為皮膚牛奶咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤、腋窩或腹股溝雀斑、Lisch結(jié)節(jié)、骨骼異常、學(xué)習(xí)障礙等。發(fā)病率約為1/3500[1]，其中約50%是自發(fā)突變，成人外顯率接近100%。本研究對(duì)3例散發(fā)患者進(jìn)行基因檢測(cè)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 病例1，女，17歲。7歲時(shí)頸部出現(xiàn)咖啡斑，逐漸增大增多，并向軀干、四肢蔓延。17歲時(shí)軀干和上肢部位開(kāi)始出現(xiàn)多個(gè)凸起皮膚表面的腫物。皮膚科檢查：全身遍布大小不一的咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤，有腋窩、腹股溝雀斑(圖1a、b)。患者弟弟、妹妹、父母均正常，否認(rèn)家族史。病例2，男，44歲。14歲時(shí)軀干開(kāi)始出現(xiàn)咖啡斑和突起皮膚表面的腫物，數(shù)量逐漸增多。皮膚科檢查：全身遍布米粒大咖啡斑和大小不一的神經(jīng)纖維瘤(圖1c、d)。患者兒子、父母均正常，否認(rèn)家族史。病例3，女，20歲。自出生起軀干部位發(fā)現(xiàn)多個(gè)咖啡斑，后逐漸增大增多。20歲時(shí)右大腿根處出現(xiàn)凸起皮膚表面的腫物。皮膚科檢查：全身遍布大小不一的咖啡斑，有腋窩、腹股溝雀斑，軀干散在分布米粒大神經(jīng)纖維瘤，右側(cè)腹股溝區(qū)有1 cm×2 cm大神經(jīng)纖維瘤(圖1e、f)。患者父母均正常，否認(rèn)家族史。3例患者均在外院行眼科檢查，未發(fā)現(xiàn)Lisch結(jié)節(jié)。本研究經(jīng)過(guò)山東省皮膚病與性病防治研究所倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者及其家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 外周血DNA提取 分別抽取3例患者及其5位家屬5 mL外周血，放置于5 mL EDTA抗凝管中，在-80℃保存。使用TGuide Large Volume Blood Genomic DNA Kit(北京天根生化科技有限公司)提取基因組DNA，質(zhì)控濃度為50 ng/μL,體積為80 μL，A260/A280比值在1.8～2.0之間。同時(shí)提取100名無(wú)NF1家族史的正常人外周血DNA作為對(duì)照組，質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)同上。

1.3 引物設(shè)計(jì)與PCR擴(kuò)增和測(cè)序 選用NF1基因cDNA參考序列(NM 001042492)作為轉(zhuǎn)錄本，利用網(wǎng)頁(yè)軟件(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)對(duì)NF1基因的58個(gè)外顯子設(shè)計(jì)特異性引物。進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)純化后在ABI 3500 xL Dx Genetic Analyzer測(cè)序儀(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Chromas 2.22軟件進(jìn)行分析，并與上述所使用的轉(zhuǎn)錄本序列進(jìn)行比對(duì)。

2 結(jié)果

病例1，第39號(hào)外顯子發(fā)生堿基G缺失(c.5635delG，圖2a)，造成移碼突變，致使轉(zhuǎn)錄提前終止(p.Cys1878Leufs*1)。病例2，第47號(hào)外顯子大片段缺失(c.7041～7062+4del,圖2b)，造成截?cái)嗟鞍桩a(chǎn)生。病例3，第21號(hào)外顯子發(fā)生堿基A、C缺失(c.2714-2715delAC，圖2c)，造成移碼突變，致使轉(zhuǎn)錄提前終止(p.Asp905Thrfs*1)。上述突變?cè)贖GMD數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.org)及近5年發(fā)表的NF1相關(guān)文獻(xiàn)中均未發(fā)現(xiàn)相同報(bào)道。在3例患者家屬及100名正常對(duì)照中均未發(fā)現(xiàn)上述突變。

a、b：病例1軀干部布滿(mǎn)咖啡斑、凸起皮膚表面的神經(jīng)纖維瘤；c、d：病例2軀干部大量的咖啡斑、神經(jīng)纖維瘤；e、f：病例3腋窩雀斑和腹股溝1 cm×2 cm大的神經(jīng)纖維瘤

圖1 患者臨床圖片

a：病例1第39號(hào)外顯子發(fā)生堿基G缺失(c.5635delG，p.Cys1878Leufs*1)；b：病例2第47號(hào)外顯子大片段缺失(c.7041～7062+4del)；c：病例3第21號(hào)外顯子發(fā)生堿基A、C缺失(c.2714-2715delAC，p.Asp905Thrfs*1)；d、e、f：正常對(duì)照序列

圖2 患者突變檢測(cè)結(jié)果

3 討論

現(xiàn)采用的診斷標(biāo)準(zhǔn)為美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院(NIH)在1988年制定，包括：(1)6個(gè)或以上的牛奶咖啡斑， 青春期前直徑大于5mm，青春期后直徑大于15mm。(2)2個(gè)及以上任何類(lèi)型的神經(jīng)纖維瘤，或1個(gè)叢狀神經(jīng)纖維瘤。(3)腋窩或腹股溝雀斑。(4)視神經(jīng)膠質(zhì)瘤。(5)2個(gè)及以上虹膜錯(cuò)構(gòu)瘤(Lisch結(jié)節(jié))。(6)骨損害，如蝶骨翼發(fā)育不良，長(zhǎng)骨皮質(zhì)細(xì)線(xiàn)化，有或無(wú)假關(guān)節(jié)。(7)一級(jí)親屬關(guān)系中有符合上述標(biāo)準(zhǔn)的NF1。以上標(biāo)準(zhǔn)符合2條即可確診NF1。

神經(jīng)纖維瘤蛋白1(neurofibromin 1，NFl)基因突變已被充分證明可引起NF1[2]。NF1基因位于17q11.2，是最大的基因之一，長(zhǎng)度為350kb，包括至少60個(gè)外顯子。高度保守的GAP關(guān)聯(lián)結(jié)構(gòu)域(GRD)是NF1上的一個(gè)重要功能區(qū)域，已被證實(shí)由20～27a號(hào)外顯子編碼[3，4]。該基因編碼包含2818個(gè)氨基酸的神經(jīng)纖維瘤蛋白，此蛋白為原癌基因Ras的負(fù)性調(diào)控因子，有抑制腫瘤的作用。NF1基因體積龐大，測(cè)序難度增大，一項(xiàng)基于109例中國(guó)NF1患者研究的突變檢出率為89%[5]。因此診斷一般依靠NIH臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，而不常規(guī)采用基因檢測(cè)的方法，但對(duì)于不符合NIH臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)的疑似患者，以及有遺傳咨詢(xún)、產(chǎn)前診斷等需求的患者，進(jìn)行NFI基因突變檢測(cè)是有必要的。到2018年2月為止，人類(lèi)基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php)已有超過(guò)2700種不同的NF1基因突變記錄在內(nèi)，類(lèi)型包括錯(cuò)義突變、剪切位點(diǎn)突變以及插入或缺失導(dǎo)致的框移突變等。其中55%的類(lèi)型為堿基插入、缺失導(dǎo)致的突變，28%的類(lèi)型為錯(cuò)義突變，16%的類(lèi)型為剪切位點(diǎn)突變。本研究3例新發(fā)突變均為堿基缺失造成截?cái)嗟鞍椎漠a(chǎn)生，推測(cè)由此影響了蛋白正常功能，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。

NF1基因具有高度可變性表達(dá)，家族內(nèi)或不同家族之間都具有顯著表達(dá)差異。Sabbagh等[6]通過(guò)對(duì)來(lái)自275個(gè)家庭的750例NFl患者的研究發(fā)現(xiàn)，臨床表現(xiàn)的相似度隨血緣關(guān)系越遠(yuǎn)而降低。即使同一個(gè)家庭具有相同突變的不同成員之間，臨床表現(xiàn)也可存有差異。有研究團(tuán)隊(duì)對(duì)8對(duì)有不同NFl癥狀的同卵雙生子進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)同卵雙生子之間NF1基因啟動(dòng)子存在明顯差異，這可能是導(dǎo)致表現(xiàn)型不同的原因[7]。目前已確定的基因型-表現(xiàn)型關(guān)系有3種：(1)框內(nèi)3 bp大小的堿基缺失(c．2970-2972 delAAT)與臨床上無(wú)神經(jīng)纖維瘤的表現(xiàn)相關(guān)[8]。(2)大片段NF1基因缺失與大量神經(jīng)纖維瘤、骨骼畸形、認(rèn)知障礙以及發(fā)生惡性腫瘤等表現(xiàn)相關(guān)[9]。(3)包括整段NF1的基因微重復(fù)與無(wú)典型NFI臨床表現(xiàn)相關(guān)，臨床表現(xiàn)有生長(zhǎng)遲緩、面部畸形、智力低下、癲癇發(fā)作[10]。

本病目前的治療方法包括手術(shù)、藥物、激光等，但均不是一勞永逸的方法，所以產(chǎn)前診斷顯得尤為重要。Merker等[11]報(bào)道目前的技術(shù)可以幫助超過(guò)95%的NFI患者找到突變位點(diǎn)，因此受該病困擾的夫婦可以借助著床前胚胎遺傳學(xué)診斷(PGD)來(lái)增加生育健康后代的幾率。DeBella等[12]研究發(fā)現(xiàn)有97%的患者在8歲之前符合NIH發(fā)布的NF1診斷標(biāo)準(zhǔn)，烏云等[13]通過(guò)基因檢測(cè)手段診斷2例僅有多發(fā)咖啡斑表現(xiàn)的無(wú)家族史低齡患兒，說(shuō)明對(duì)于學(xué)齡前不符合診斷標(biāo)準(zhǔn)的疑似兒童進(jìn)行基因檢測(cè)，在早診斷、早干預(yù)方面有重要意義。該病無(wú)論從外觀(guān)和健康方面對(duì)患者均是一種負(fù)擔(dān)，本文中2例年輕女性患者有下一代產(chǎn)前診斷的需求，檢測(cè)突變位點(diǎn)對(duì)她們?nèi)蘸髢?yōu)生優(yōu)育有一定參考價(jià)值。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)的3種新發(fā)突變豐富了中國(guó)人群NF1基因的突變譜，為NF1相關(guān)研究打下基礎(chǔ)。對(duì)于臨床表現(xiàn)未達(dá)診斷標(biāo)準(zhǔn)以及有遺傳咨詢(xún)需求的患者，可以考慮NF1基因突變分析，明確診斷并據(jù)病情發(fā)展行針對(duì)性隨訪(fǎng)觀(guān)察。