納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及機制

陸 敏 孫湖泊 李 妍

(吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013)

納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及機制

陸 敏 孫湖泊1李 妍

(吉林醫藥學院，吉林 吉林 132013)

目的 探討納米二氧化硅對大鼠心肺的損傷作用及其分子機制。方法 成年雄性Wistar大鼠16只，隨機分為對照組及納米二氧化硅染毒組，通過氣管滴注50 nm粒徑的納米二氧化硅構建大鼠染毒模型。染毒30 d后稱重并計算大鼠臟器系數，蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠心、肺組織形態學變化，免疫組織化學法檢測大鼠心、肺轉化生長因子(TGF)-β1、 p-Smad2/3信號分子的表達活性。結果 與對照組相比，納米二氧化硅染毒組大鼠臟器系數沒有顯著改變，HE染色可見納米二氧化硅對大鼠心、肺組織損傷明顯，免疫組織化學染色結果顯示納米二氧化硅染毒組大鼠心、肺TGF-β1陽性細胞數明顯增加，而p-Smad2/3表達量在心組織中無明顯改變，在肺組織中明顯增高。結論 50 nm粒徑的二氧化硅可引起大鼠心、肺組織損傷，其作用可能與TGF-β1信號分子的活化有關。

納米二氧化硅；心肺損傷；轉化生長因子β1

納米二氧化硅顆粒因其純度高、裝載量大、分散均勻等特性，被廣泛應用于橡膠、塑料、纖維材料、添加劑、潤滑油及藥物載體等產品的生產。實驗證實，納米二氧化硅對實驗動物及細胞模型均具有明顯的毒性作用〔1〕。Flaherty等〔2〕研究發現，納米二氧化硅慢性暴露不僅能夠引起小鼠肺泡巨噬細胞模型產生急性毒性效應，同時能夠引起機體發生慢性炎癥反應，并導致細胞中活性氧的生成。Okoturo-Evans等〔3〕通過MTT實驗及流式細胞術等實驗技術證實，納米二氧化硅染毒能夠導致A549肺上皮細胞中凋亡相關蛋白，如UCP2及calpain-12的表達量異常升高，提示納米二氧化硅具有明確的細胞毒性作用。Musa等〔4〕研究顯示，納米二氧化硅能夠引起人肺支氣管上皮細胞BEAS-2B及小鼠的淋巴結細胞DNA損傷。本研究旨在探討納米二氧化硅對大鼠心肺的毒性作用及其引起心肺損傷的可能分子機制。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 JEM-1011 型透射電鏡(日本電子株式會社)，光學顯微鏡(Olympus，日本)，JA1203電子天平(上海精密科學儀器有限公司，中國)，低溫高速離心機(Eppendorf，德國)，全自動梯度脫水機(Leica，德國)，納米二氧化硅(阿拉丁，中國)，羥脯氨酸(HYP)試劑盒(南京建成生物工程研究所，中國)，p-Smad2/3、Smad2及Smad3抗體(Cell Signaling Technology，美國)，轉化生長因子(TGF)-β1抗體(Abcam生物科技公司，美國)，其他試劑均為國產分析純。

1.2 實驗動物分組和處理 健康SPF級雄性Wistar大鼠16只，體重(200±20)g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供(實驗動物批準號：2011-x-072)。隨機分為兩組，每組8只。對照組大鼠氣管滴注及灌胃生理鹽水；染毒組大鼠采用非暴露式的氣管滴注染毒及灌胃生理鹽水，隔日染毒；共處理30 d。50 nm粒徑的納米二氧化硅作用濃度為10 mg/kg體重。

1.3 大鼠心、肺臟器系數檢測 全部實驗大鼠處死前稱重，處死后迅速取出大鼠心及肺，生理鹽水沖洗并用濾紙吸干水分，稱重并計算臟器系數。臟器系數=(臟器濕重/體重)×100%。

1.4 大鼠心、肺組織形態學觀察 對照組及染毒組大鼠心、肺用10%多聚甲醛固定24 h后，經梯度濃度的乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟和包埋后做常規石蠟切片，并進行蘇木素-伊紅(HE)染色，觀察大鼠心、肺組織細胞形態學變化。

1.5 大鼠心、肺TGF-β1、 p-Smad2/3信號分子活性檢測 免疫組化法檢測大鼠心、肺細胞中TGF-β1、p-Smad2/3的表達情況。心、肺組織切片后分別按照免疫組織化學染色的步驟進行不同信號分子的抗體孵育及染色過程，顯微鏡下觀察相應切片，并對每個400倍視野下的陽性細胞數進行計數。

1.6 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行t檢驗和單因素方差分析。

2 結 果

2.1 大鼠心、肺臟器系數檢測 臟器系數是實驗動物某臟器的重量與其體重的比值數，正常時各臟器與體重的比值比較恒定。與對照組(心系數0.360 7%，肺系數0.523 3%)相比，10 mg/kg體重的納米二氧化硅暴露對于大鼠心系數(0.359 3%)及肺系數(0.498 1%)均沒有明顯影響。

圖1 納米二氧化硅對大鼠心、肺 組織形態的影響(HE，×400)

2.2 大鼠心、肺病理學改變 見圖1。對照組大鼠心肌纖維排列較為整齊緊密，染毒組大鼠的心肌纖維之間間隙增大，心肌細胞水腫明顯。對照組肺組織的支氣管結構清晰，其肺泡間隔無明顯增寬，且無炎細胞浸潤，肺泡腔內無明顯的滲出及出血。而染毒組大鼠肺組織充血，肺間隔增厚、變寬，顯微鏡下可見巨噬細胞增生。

2.3 TGF-β1、p-Smad2/3表達的改變 TGF-β1、p-Smad2/3免疫組織化學染色陽性細胞的細胞核或細胞質內含有黃色或棕黃色顆粒(圖2，圖3)。染毒組大鼠的心、肺組織中TGF-β1(223，160)陽性細胞數均明顯高于對照組(P<0.01)。肺組織中p-Samd2/3陽性細胞數(2.75)明顯高于對照組(0.75，P<0.05)。而心臟中p-Smad2/3陽性細胞數(1.00)與對照組(0.75)未見明顯差異(P>0.05)。

圖2 納米二氧化硅對大鼠心、肺細胞中 TGF-β1表達量的影響(DAB，×400)

圖3 納米二氧化硅染毒大鼠心、肺 p-Smad2/3組織學檢查結果(DAB，×400)

3 討 論

近年來，隨著納米二氧化硅在工業上的廣泛應用及環境污染的日益嚴重，人群接觸其的機會越來越多，納米二氧化硅對人體的生物學效應也逐漸引起人們的關注。本研究證實一定濃度的納米二氧化硅對大鼠具有明顯的心肺損傷作用。有研究指出，環境中的納米材料可通過呼吸道、皮膚、消化道進入哺乳動物體內，并通過淋巴循環及血循環到達全身各組織器官，引起機體廣泛的生物學效應〔5,6〕。臟器系數常用于檢測藥物及毒物對實驗動物的各臟器的影響，筆者測定了染毒大鼠的心肺臟器系數，顯示10 mg/kg體重的納米二氧化硅暴露30 d并未引起大鼠心肺臟器系數的明顯變化，提示納米二氧化硅對大鼠的損傷作用可能較為廣泛，而非心、肺特異性損傷。

TGF-β信號轉導通路在許多生理及病理過程中均發揮著重要的作用。其中，TGF-β1基因在正常組織細胞中處于沉默狀態，當機體受到內外環境變化的影響而發生損傷時，組織細胞中的TGF-β1基因活化，并參與損傷組織的炎癥反應及損傷修復過程〔7～9〕。通過體外劃痕實驗研究發現，給予TGF-β1能夠促進膠原蛋白的生成及遷移〔10〕。Takano等〔11〕研究發現，Ⅱ型肺泡上皮細胞RLE/Abca3給予TGF-β1 后，細胞形態發生明顯改變，呈細長的成纖維細胞樣；同時上皮細胞標志物細胞角蛋白(CK)19及Abca3表達量下降，間充質標志物如α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)增加，并促進了細胞板層體的形成。本實驗結果證實，納米二氧化硅染毒能夠促進大鼠心、肺TGF-β1表達量的明顯增多，說明納米二氧化硅可能是通過激活TGF-β1信號轉導通路而影響心、肺功能的。

p-Smad2/3是TGF-β1的重要下游信號分子，當TGF-β1與受體結合后，可以進一步活化細胞中的Smad2/3，使之磷酸化活化，并從細胞質向細胞核轉移，將信號轉至核內，引起相應基因表達改變〔12～14〕。本研究結果提示TGF-β1在不同的組織器官可能激活不同的下游信號分子，產生不同的損傷效應機制。

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〔2016-11-14修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

國家自然科學基金資助項目(No.81372952)；吉林省教育廳科研項目(No.2015407)

李 妍(1974-)，女，副教授，博士，主要從事神經毒理學相關機制研究。

陸 敏(1993-)，女，主要從事衛生毒理學研究。

R135.2

A

1005-9202(2017)09-2092-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.09.005

1 北京體育大學附屬醫院