基于功能化納米復合材料的新型辣根過氧化物酶生物傳感器的研究技術

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(河南大學 生命科學學院，河南 開封 475000)

生物傳感器誕生于上世紀六十年代，經過50多年的不斷改進和發展，各種新型材料、技術手段逐漸被引入生物傳感器的研究，給生物傳感器領域增添了新的生機與活力。在生物傳感器中，酶生物傳感器的出現打破了傳統的做法和思維，成為生物傳感領域的一大熱門研究方向。研究者嘗試將各種新型材料引入生物傳感領域，尤其是納米材料的發展，將生物傳感器的研究帶入了一個新階段。生物傳感器中最常用的是酶電極，酶電極制備的關鍵就是如何在保持酶活性的同時將酶固定在電極上。然后用各種方法對其機制進行研究。

1 不同材料在辣根過氧化物酶傳感器中的應用研究

許淑霞,吳金生等[1]針對用純物理方法固定酶易使其脫落的問題，為解決這一問題，他們將納米金與HRP混合物再固定在多壁碳納米管(MWNTs)修飾的Pt電極上，且碳納米管、納米金對電流有放大作用，大大提高了傳感器的靈敏度和穩定性，具有更高的應用價值。

祝敬妥，張卉等[2]將殼聚糖和無摻雜的金剛石納米粒子(UND)電沉積到玻碳電極表面，再進一步固定上HRP。又用SEM表征、電化學交流阻抗、循環伏安等技術來研究復合膜及HRP生物活性。即此復合膜實現了HRP和電極之間的直接電子傳遞，可用于研制更靈敏的過氧化氫傳感器。

馮亞娟，魏玉萍等[3]經Hummer法等自主合成了氧化石墨烯(GO)，并將其與納米金顆粒、殼聚糖(CHIT)及HRP混合修飾到玻碳電極上，制得H2O2傳感器。通過檢測pH值、工作電位的影響優化實驗條件，很好地增長了傳感器的使用壽命。

接德麗 ，徐歡等[4]利用既環保又有良好的生物相容性肌醇六磷酸鈣(Ca-IP6)與HRP共同制得Nafion/HRP/Ca-IP6/GCE傳感器。檢測發現，該電極對過氧化氫，響應迅速、穩定性好。

姚慧，李小紅等[5]用室溫離子液體作粘合劑，在石墨中加入一定量的碳納米管制成新型碳糊電極后，用于H2O2的檢測。檢測結果表明，這種新型碳糊電極對過氧化氫響應迅速，電催化活性高，更有利于電子的有效傳遞，同時良好的穩定性和選擇性使其在實時檢測中具有更廣闊的應用前景。

2 各種電化學方法用于實驗結果的分析討論

電化學分析根據測量方法能分為許多種，其中循環伏安法(CV)是最為常用的一種研究方法，其可對電極上的電活性物進行定性、定量分析，以得到電極反應過程的電子轉移數、電子傳遞速率、熱力學可逆性和各種動力學參數等，從而能進一步了解電極反應的機制機理。

2.1 表征

潘羽俠等[7]利用微波合成法合成植酸鈦納米材料，并與辣根過氧化物酶共修飾到玻碳電極表面，又用場發射掃描電子顯微鏡(FESEM)分別表征了植酸鈦與HRP混合前后的形貌變化，來說明HRP已經很好地修飾到植酸鈦上，這種結構也有助于實現直接電子傳遞。

焦守峰等[8]合成了金納米粒子修飾的PDA球，對其進行詳細的表征，SEM圖上可觀察到PDA納米球上均勻地修飾上了AuNPs，更進一步確定了其形貌和組成。

2.2 修飾電極的直接電化學行為

陳緒胄，李建平[9]用不同電極在磷酸鹽緩沖溶液中于0.1～-0.6V間進行循環伏安掃描，結果顯示，HRP/Ag/Cys/GCE 電極有一對氧化還原峰，并且 HRP在Ag/Cys/GCE電極表面能進行穩定、有效的直接電子轉移。根據 HRP/Ag/Cys/GCE電極在 0.067 mol/L PBS(pH值7.0)中不同掃描速度下的循環伏安曲線，可做出氧化還原峰值電流大小與掃速的平方根呈線性關系，來表明該電極表面擴散的機制。

焦守峰等[8]研究了不同電極的電化學行為，發現AuNPs對HRP 的直接電化學過程至關重要。Nafion/HRP-Au/PDA/GC 電極的CV 圖上分別在-347 mV 和-378 mV 給出了HRP的氧化峰和還原峰，對應于HRP-Fe(III)/HRP-Fe(II) 電對的單電子氧化-還原過程。由于PDA表面對蛋白質的強吸附作用，HRP 的式量電位更接近其氧化還原標準式量電位。且隨著H2O2的加入，HRP 的氧化峰電流逐漸減小，還原峰電流線性增加?；诖?，可采用計時電流法，有望在0.10～0.30 μmol/L范圍內用于實際樣品中生物反應產生的H2O2的檢測。

2.3 檢測條件的優化

2.3.1 修飾電極對H2O2的催化響應

姚慧等[5]用制成的新型碳糊酶電極(HRP/MWCNTs/CILE)，在適合的磷酸緩沖溶液中對H2O2檢測，發現還原峰和氧化峰強度均增大，這說明HRP對于H2O2的還原有明顯的催化作用。

高海燕等[11]用聚氨酯丙烯酸酯預聚體和辣根過氧化物酶混合修飾在玻碳電極表面，通過光固定法制備得到HRP-PUA/GC電極。檢測HRP-PUA/GC電極對H2O2的催化活性時發現，氧化峰和還原峰峰值電流均有明顯的變化。

2.3.2 pH值的影響

王超凡等[12]用乙二胺將酪氨酸酶(Tyr)固定在功能化GO修飾的玻碳電極(GCE)上。然后用不同pH值檢測對HQ影響時發現，pH值6.5時氧化峰值電流達到最大；這與該酶pH值的相近，酶的活性未被改變，因此選擇pH值6.5作為該體系測試的pH值。

趙紅葉等[13]基于SiO2和Fe3O4納米粒子構置出Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO電極，研究了血紅蛋白在該電極上的電子傳遞的機制，并考察了溶液pH值對Hb-Fe3O4-SiO2-Chit/ITO中Hb的循環伏安行為的影響，發現E0'與pH值的斜率為-48.3 mV·pH值-1，這與一電子一質子反應的理論值(-59.0mV·pH值-1)接近。當溶液pH值=7.0時，Hb的響應最大，因此實驗選擇pH值7.0的PBS作支持電解質。

2.3.3 工作電位的影響

馮亞娟，魏玉萍等[3]將合成的氧化石墨烯與納米金顆粒、殼聚糖、辣根過氧化酶混合修飾到玻碳電極上，然后進行條件優化，在測試工作電位時，發現在-0.10 V作為工作電位時可以避免一些干擾物在負電位下的還原。

黃銳[14]在新型碳納米材料的酶及生物堿電化學傳感技術研究中，用全修飾的新電極，在優化檢測電位時發現，當工作電位從-0.4V上升到-0.25V，響應電流逐漸增大；-0.25V上升到-0.1V時，還原電流又呈現減小的趨勢。在過負的電位下，一些物質容易發生還原反應而產生干擾。故實驗選擇-0.25V作為檢測電位。

2.4 穩定性和重現性

高海燕等[11]將HRP-PUA/GC電極在合適的PBS中連續循環掃描，結果發現，除最開始的1圈峰形有異常外，之后的峰電流仍然幾乎不變，表明HRP在電極表面的直接電子轉移隨連續掃描次數的增加是相當穩定的。然后又將全修飾電極保存在相應的PBS中一個月，其伏安響應幾乎無明顯變化，進一步表明該電極有極高的穩定性。

郭小玉，苗云等[15]將修飾好的Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE電極進行穩定性測試。先在PBS中以100 mV/s 連續掃描50圈，其響應電流無變化。Nafion/HRP-IP6 micelles-GNPs/GCE 傳感器放置在4℃下儲存30d后，測定其循環伏安電流及峰位置是否發生變化，且得到的響應電流為初始電流的94%。因此，全修飾電極有很好的穩定性。

2.5 抗干擾性測試

王超凡等[12]用乙二胺將Tyr共價修飾到功能化GO上。然后對該電極進行一些干擾物質的檢測，其誤差控制在±5%以內，對0.2 mmol/L HQ溶液進行測定。結果顯示，大多離子和酚類的有機物對HQ的測定不會造成干擾。

馬麗萍等[16]將HRP直接固定在電聚合ZrO2修飾的金電極表面制得了新型HRP酶生物傳感器。在含有0.15 mmol/L H2O2的PBS中，分別加入0.30 mmol/L的5種干擾物質，測定它們對該傳感器響應信號的干擾情況。實驗結果表明，這些物質基本不會影響H2O2的測定。

3 展望

隨著各種新型材料的問世，酶的直接電化學已進入到一個新的發展階段。越來越多的科研工作者嘗試使用納米金、富勒烯、納米二氧化鈦、離子液體等多種材料與酶結合，構建出許多新型的生物傳感器，大大拓寬了其應用范圍，在科學研究、疾病診斷、食品檢測、環境監測等領域具有重要作用。本文著重總結了近年來酶生物傳感器領域的一些研究成果，并列舉出一些實驗結果的電化學分析方法，希望對生物傳感器的研究原理和過程有更清晰的認識，更期望通過學習前人的大量實驗成果，尋找到生物傳感器領域的新突破。

致謝: 感謝河南大學生命科學學院對本項目以及參加全國大學生生命科學聯賽的大力支持。